UPLC-MS法同时测定大鼠血浆中氧化芍药苷、 没食子酸及咖啡酰基奎宁酸类成分

郑 林， 唐 丽， 牟景丽， 黄 勇， 董 莉， 兰燕宇*

（1.贵阳医学院药学院， 民族药与中药开发应用教育部工程研究中心， 贵州 贵阳 550004； 2.贵州省药物制剂重点实验室， 贵州 贵阳 550004）

［制 剂］

UPLC-MS法同时测定大鼠血浆中氧化芍药苷、 没食子酸及咖啡酰基奎宁酸类成分

郑 林1，2， 唐 丽1， 牟景丽1， 黄 勇1，2， 董 莉1，2， 兰燕宇1，2*

（1.贵阳医学院药学院， 民族药与中药开发应用教育部工程研究中心， 贵州 贵阳 550004； 2.贵州省药物制剂重点实验室， 贵州 贵阳 550004）

目的 建立 UPLC-MS 法同时测定大鼠静脉注射辛芍 （灯盏细辛和赤芍） 提取物后血浆中氧化芍药苷、 没食子酸、 1，3-二咖啡酰基奎宁酸、 3，4-二咖啡酰基奎宁酸、 4，5-二咖啡酰基奎宁酸 5 种成分的分析方法。 方法 血浆样品酸化后经乙腈沉淀除去蛋白， UPLC分析采用 Waters Acquity BEH C18色谱柱， 流动相为 0.1%甲酸乙腈 -0.1%甲酸水梯度洗脱，采用电喷雾电离源，扫描方式为选择性离子监测模式。结果 5种成分在血浆中线性关系良好，提取回收率 91.95% ～109.09%， 日内、 日间精密度和准确度良好， 被测成分在大鼠体内消除较快。 结论 本分析方法特异、快速、 准确灵敏， 可用于氧化芍药苷、 没食子酸、 1，3-二咖啡酰基奎宁酸、 3，4-二咖啡酰基奎宁酸、 4，5-二咖啡酰基奎宁酸的药代动力学研究。

UPLC-MS； 药动学研究； 辛芍提取物； 大鼠

在贵州少数民族地区常用灯盏细辛和赤芍组方（简称 “辛芍组方”） 用于治疗中风、 偏瘫， 具有较好的临床疗 效［1-2］。 本方以灯 盏细辛 为君， 化瘀通络，赤芍凉血热、通经络，治血热瘀滞，助君药以达活血化瘀、散瘀通络之效。课题组在前期研究中发现该组方能迅速改善脑缺血动物的症状，对脑缺血性大鼠及小鼠有明显保护作用；增加大鼠脑血流， 改善 缺 血 大 鼠 脑 微 循 环［3-6］。 为 了 “ 辛 芍 组方”的深层次开发利用，本实验在参考有关文献基础上［7-8］， 以氧 化 芍 药苷、 没 食 子 酸、 1，3-二 咖啡酰基奎宁酸、 3、4-二咖啡酰基奎宁酸、 4，5-二咖啡酰基奎宁酸为检测指标， 采用 UPLC-MS 法研究大鼠静脉注射辛芍提取物后所测成分的药代动力学特征， 并应用 DAS 2.0 软件计算各物质的药动学参数，进而分析辛芍提取物在大鼠体内的体内过程，为辛芍组方的临床应用提供实验依据。

1 材料

1.1 仪器 Acquity系统超高液相色谱-三重四级杆串联质谱仪 （ 美国 Waters公司， 包括二元梯度泵、自动进样器、柱温箱、三重四级杆质量分析器和 Masslynx4.1 质谱工作站）； Allegra 64R高速离心机 （美国 Beckman Coulter公司） ； ZH-2 涡旋混合器 （天津药典标准仪器厂）； MTN-2800D氮吹仪（天津奥特塞恩斯公司）； AE240 分析天平 （梅特勒-托利多仪器上海有限公司）； CQ 250A-TS 超声波清洗机 （上海跃进医用光学器械厂）。

1.2 试 剂 与 试 药 没 食 子 酸 （ 批 号 110831-200803）、1，3-O-二咖 啡 酰 奎 宁 酸 （ 批号 111717-200501）、 葛 根素 （ 内 标， 批 号 110752-200912 ）对照品购自中国食品药品检定研究院；氧化芍药苷（批号 20120310）、3，4-O-二咖啡酰奎宁酸 （批号Y59-20130115 ）、4， 5-O-二 咖 啡 酰 奎 宁 酸 （批 号1384-101215） 对照品购自中药固体制剂制造技术国家工程研究中心； 辛芍提取物自制 （批号20120615）； 色谱乙腈 （德国 Merck 公司）；水为超纯水；其余溶剂均为分析纯。1.3 实验动物 健康 SD大鼠 6 只， 雌雄兼用，体质量为 （230 ±10） g， 由贵阳医学院动物中心提供， 动物许可证号 SCXK （黔） 2002-0001。

2 实验方法

2.1 标准溶液的配制 精密称取氧化芍药苷、 没食子酸、 1，3-二咖啡酰基奎宁酸、 3，4-二咖啡酰基奎宁酸、 4，5-二咖啡酰基奎宁酸适量，用甲醇溶解定容至 10 mL。 获得氧化芍药苷 （0.97 mg/mL）、没食子酸 （0.56 mg/mL）、 1，3-二咖啡酰基奎宁酸（0.482 mg/m L）、 3，4-二咖啡酰基奎宁酸 （0.595 mg/mL）、 4， 5-二 咖 啡 酰 基 奎 宁 酸 （ 0.470 6 mg/mL） 的贮备液。 取葛根素贮备液适量， 置 25 m L量瓶中加甲醇稀释至刻度，获得葛根素工作溶液 （20 μg/mL）， 置冰箱 （ -20 ℃） 保存， 备用。

2.2 色 谱 条 件 Waters Acquity BEH C18色 谱 柱（2.1 mm×50 mm， 1.7 μm）； 流动相为 0.1%甲酸乙腈 （ A） -0.1%甲酸水 （B）， 梯度洗脱 （0 ～3 min， 5% ～25%A； 3 ～4 min， 25% ～90%A；4 ～5 min， 90% ～5%A）； 体 积 流 量 为 0.35 mL/min；柱温 45 ℃， 进样器的温度 15 ℃， 进样体积为1 μL。

2.3 质谱条件 采用电喷雾电离源 （ESI）， 毛细管电离电压 3 kV，离子源温度 120 ℃； 喷雾气与反吹气为 N2， 去溶剂气体积流量 650 L/h， 去溶剂气温度350 ℃， 反吹气体积流量为50 L/h； 扫描方式为选择性离子监测模式 （SIR）， 质谱数据采集及处理软件为 MassLynx V4.1 工作站。 氧化芍药苷等5种成分及内标用于定量分析的监测离子质谱信息见表1。

表1 5种成分的质谱条件Tab.1 Five com ponen tsm ass spectrometric conditions

2.4 血浆样品处理方法 取大鼠血浆 100 μL，依次加 入 10 μL内 标 葛 根 素 溶 液 （20 μg/mL），50 μL 1%甲 酸 溶液， 400 μL乙腈， 涡 混 1 min，15 000 r/min， 离心 10 min， 取上清液置离心管中，45 ℃氮气吹干，残留物用 300 μL甲醇溶解， 离心， 取上清1μL进样。

3 结果

3.1 专属性 取大鼠空白血浆 100 μL， 除不加内标外， 其余按 “2.4” 项下操作， 得空白样品色谱图A；将一定浓度的混合标液和内标溶液加入空白血浆，依法操作，得相应色谱图 B；取大鼠给药后血浆， 依法操作， 得相应色谱图 C， 见图 1。 由结果可以看出氧化芍药苷等5种成分分离良好，基质无干扰。

图 1 SIR色谱图Fig.1 SIR chromatograms

3.2 线性范围和灵敏度 取大鼠空白血浆100 μL，依次加入系列混合标准溶液 50 μL， 按 “血浆样品处理方法”项下操作，建立标准曲线。以待测物的峰面积与内标峰面积之比 （ A/Ai） 为纵坐标 Y，各物质质量浓度 （C） 为横坐标 X进行直线回归，权重系数为 1/X， 求出直线方程， 即为标准曲线。 5个成分的线性方程分别为：氧化芍药苷 Y= 1.004 8X+0.040 3 （ 线 性 范 围 0.048 ～11.55 μg/mL， r＞0.996）、没食子酸 Y=1.565X+0.099（0.067 ～16.19 μg/mL， r＞0.999 4）、 1，3-二咖啡酰基奎 宁 酸 Y=0.823X+0.010 2 （0.024 ～5.738 μg/mL， r＞0.999）、3，4-二咖啡酰基 奎宁酸 Y= 1.169X+0.001 5 （0.029 ～7.083 μg/mL， r=1）、4，5-二 咖 啡 酰 基 奎 宁 酸 Y=0.920 7X+0.001 7（0.023 ～5.602 μg/mL， r＞0.999 8）。

3.3 准确度和精密度 按 “3.2 标准曲线” 项下分别配制 5个成分大鼠血浆质量控制样品（QC）， 每一个质量浓度进行 5 样本分析， 连续测定3 d。 氧化芍药苷、 没食子酸、 1，3-二咖啡酰基奎宁酸、 3，4-二咖啡酰基奎宁酸、 4，5-二咖啡酰基奎宁酸5个成分准确度、日内、日间精密度均良好，结果见表2。

表2 大鼠血浆中5种成分的日内、 日间精密度和准确度（， n=6， 3 days）Tab.2 Accuracy， intra-and inter-day precision of the five components（， n=6， 3 days）

表2 大鼠血浆中5种成分的日内、 日间精密度和准确度（， n=6， 3 days）Tab.2 Accuracy， intra-and inter-day precision of the five components（， n=6， 3 days）

检测成分加入质量浓度/（ μg·m L-1）血浆质量浓度/（ μg·mL-1）日内精密度RSD/%日间精密度RSD/%准确度/%没食子酸氧化芍药苷1，3-二咖啡酰基奎宁酸3，4-二咖啡酰基奎宁酸4，5-二咖啡酰基奎宁酸0.20 0.21 ±0.01 3.37 6.76 105.00 1.80 1.74 ±0.01 0.87 2.26 97.00 16.20 15.66 ±0.17 1.12 0.67 96.65 0.14 0.14 ±0.01 6.06 3.90 98.57 1.28 1.28 ±0.02 1.56 1.77 100.00 11.55 11.21 ±0.42 3.82 2.52 97.09 0.07 0.07 ±0.01 1.84 6.65 100.00 0.64 0.64 ±0.02 2.39 3.24 99.06 5.74 5.51 ±0.09 1.61 1.25 96.06 0.09 0.09 ±0.01 0.99 1.15 100.00 0.79 0.76 ±0.02 2.08 0.80 96.20 7.08 6.92 ±0.08 0.98 3.59 97.68 0.07 0.07 ±0.01 6.21 5.04 102.86 0.62 0.64 ±0.03 4.82 6.63 103.23 5.60 5.34 ±0.16 2.93 3.63 95.29

3.4 提取回收率和基质效应考察 配制 5 个成分的大鼠血浆低、中、高3个质量浓度的质量控制样品（QC）， 按 “2.4 血浆样品处理” 项下操作， 获得相应峰面积值 （A）； 另取空白血浆， 按 “血浆样品处理”项下操作，离心后获得上清液，加入与上述相应质量浓度的标准溶液， 于 30 ℃氮气吹干， 以 300 μL甲醇复溶， 获得相应峰面积值 （B）； 另取上述低、中、 高3 个质量浓度的对照溶液 50 μL与内标10 μL， 30 ℃氮气吹干， 残留物以300 μL甲醇复溶，得相应峰面积 （C）， 每一个质量浓度均以 5 样本进行分析， 内标同法考察。 以 A/B（%） 计算提取回收率， B/C（%） 计算基质效应。氧化芍药苷、没食子酸、 1，3-二咖啡酰基奎宁酸、3，4-二咖啡酰基奎宁酸、 4，5-二咖啡酰基奎宁酸 5 个成分的提取回收率为 91.95% ～109.09%， 基质效应为 91% ～108%，内标葛根素提取回收率为 94.31%， 基质效应为91.64%， 表明均不存在明显的基质效应。

3.5 稳定性考察 对氧化芍药苷等 5 种成分低、中、高3个质量浓度处理后的血浆样品在自动进样器中0、 3、 6 h 及在室温 （约 20 ℃） 下放置 6 h，4 ℃下冷藏 8 h 和冻融 3 次的稳定性 （n=3） 进行了考察， 结果表明氧化芍药苷、 没食子酸、 1，3-二咖啡酰基奎宁酸、 3，4-二咖啡酰基奎宁酸、 4，5-二咖啡酰基奎宁酸5个成分在各条件下均稳定，其RSD%小于 10.05%。

3.6 药动学实验 健康 SD大鼠 6 只， 雌雄各半，体质量为 （230 ±10） g， 给 药前 12 h 禁 食， 自由饮水。取适量辛芍提取物溶于生理盐水，离心，尾静脉注射辛芍提取物溶液 34 mg/（mL·kg） 。 于给药前与给药后 5、 10、 20、 30、 45、 60、 90、 120、140 min 经 尾 静脉取 血 约 0.35 mL置 涂 有 肝 素 的 塑料离 心 管 中， 5 000 r/min 离 心 10 min， 分 离 血 浆于 -20 ℃冰箱中保存。 实验所有数据均用表示， 采用 DAS 2.0 软件 （ 中 国 数 学 药 理 专 业 委 员会）计算相关药动学参数，并对药物在大鼠体内的动力学过程进行房室模型拟合。氧化芍药苷等5个成分的 C-t曲线见图 2，药动学参数见表 3。

图 2 大鼠静脉注射辛芍提取物后氧化芍药苷等 5 种成分的 C-t曲线 （， n=6）Fig.2 Concentration-time profiles of five com ponents after i.v of Xinshao extract to rat（， n=6）

表3 氧化芍药苷等5种成分的主要药动学参数 （， n=6）Tab.3 Pharmacokinetic parameters describing disposition after i.v of Xinshao extract to rat（， n=6）

表3 氧化芍药苷等5种成分的主要药动学参数 （， n=6）Tab.3 Pharmacokinetic parameters describing disposition after i.v of Xinshao extract to rat（， n=6）

矩参数 单位 氧化芍药苷 没食子酸 1，3-二咖啡酰基奎宁酸 3，4-二咖啡酰基奎宁酸 4，5-二咖啡酰基奎宁酸AUC（0-140min）mg/（ L·min）统计46.83 ±11.15 221.19 ±66.26 27.29 ±22.66 45.87 ±15.26 48.04 ±28.46 AUC（0-∞） mg/（ L·min） 52.12 ±19.58 225.74 ±71.55 28.35 ±22.99 55.39 ±18.88 51.63 ±28.81 MRT（0-140min） min 30.26 ±5.78 29.16 ±2.46 31.01 ±5.18 35.86 ±5.11 32.13 ±9.10 MRT（0-∞） min 51.46 ±48.87 31.05 ±3.45 39.43 ±14.44 63.63 ±36.28 43.38 ±15.81 t1/2z min 16.95 ±11.86 20.99 ±10.18 38.12 ±16.77 57.50 ±36.05 42.80 ±22.29 CLz L/（min·kg） 2.21 ±1.26 0.50 ±0.28 7.41 ±4.22 1.98 ±1.41 2.30 ±1.79 Vz L/kg 54.25 ±33.23 15.11 ±8.91 335.20 ±51.72 173.07 ±92.13 57.84 ±44.33 Zeta 0.04 ±0.02 0.04 ±0.02 0.02 ±0.01 0.02 ±0.01 0.02 ±0.01

4 讨论

4.1 本实验建立了 UPLC-MS 法同时测定大鼠静脉注射辛芍提取物后的多指标成分的药代动力学方法，结果表明此方法特异、快速、准确、灵敏。

4.2 实验过程中对多种内标进行了考察， 但许多物质的出峰时间均与内源性物质有干扰或出峰时间较晚，最后选择了黄酮类的葛根素，证明以葛根素为内标回收率稳定，出峰时间合适，与样品峰及血浆基质无干扰。

4.3 药动学参数结果表明： 氧化芍药苷、 没食子酸、 1，3-二咖啡酰基奎宁酸、 3，4-二咖啡酰基奎宁酸、 4，5-二咖啡酰基奎宁酸 5 个成分在大鼠体内符合二室药动学模型。各物质在大鼠体内消除较快，这可能与物质的理化性质有关， 且各物质的药-时曲线面积相差较大，可能与各物质在提取物中的含量和在大鼠体内的暴露程度不同有关。

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Sim ultaneous determ ination of hydroxyl-paeoniflorin， gallic acid and dicaffeoylquinic acid in rat p lasm a by UPLC-MS

ZHENG Lin1，2， TANG Li1， MOU Jing-li1， HUANG Yong1，2， DONG Li1，2， LAN Yan-yu1，2*
（1.School of Pharmacy， Guiyang Medical College， Engineering Research Center for the Development and Application of Ethnic Medicines and TCM ，Ministry of Education， Guiyang 550004， China； 2.Provincial Key Laboratory of Pharmaceutics in Guizhou Province， Guiyang 550004， China）

AIM To develop a UPLC-MSmethod for simultaneously determing the contents of hydroxyl-paeoniflorin，gallic acid， 1，3-dicaffeoylquinic acid，3，4-dicaffeoylquinic acid， and 4，5-dicaffeoylquinic acid after intravenous administration of Xinshao extract（ Erigerontis Herba， Paeoniae Radix rubra） in rat plasma.M ETHODS Following a protein precipitation with acidified acetonitrile for plasma samples.The UPLC analysis was performed on Waters Acquity BEH C18column and the mobile phase consisting of acetonitrile and water（ containing 0.1%formic acid） in gradient elution manner.The compounds were ionized in the electrospray ionization ion source of themass spectrometer and detected in the selective ion monitoringmode.RESULTS Good linearity was achieved for the five compounds， the extraction recovery was between 91.95%to 109.09， the intra-and inter-day precisions and the accuracy were good.The five compounds were eliminated in vivo rapidly.CONCLUSION Themethod is specific， sensitive and suitable for the pharmacokinetic studies of the five compounds.

UPLC-MS； pharmacokinetics； Xinshao extract； rat

R969.1

： A

： 1001-1528（2014）05-0937-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.05.012

2013-06-08

国家自然科学基金 （81060335）； 贵州省社会发展攻关计划 （黔科合 SY字 ［2011］ 3033 号）； 贵州省科学技术基金 （黔科合 J字 ［2012］ 2029 号）； 贵州省中药现代化科技产业研究开发专项 （黔科合中药字 ［2011］ 5081 号）

郑 林 （ 1981—）， 女， 博 士生， 副教 授， 主 要从事 中 药 药 效 物 质 基 础 及 质 量 控 制 研 究。 Tel： （ 0851 ） 6908468， E-mail：mailofzl@126.com

*通信作者： 兰燕宇 （1958—） ， 女， 教授， 主要从事中药药效物质基础研究及新药研究开发。 Tel：（0851 ）6908899， E-mail： yanyu626 @126.com