黄颡鱼性别连锁标记Pf62-Y的染色体定位

丹 成王 达桂建芳

(1. 中国科学院水生生物研究所, 淡水生态与生物技术国家重点实验室, 武汉430072; 2. 中国科学院大学, 北京 100049)

黄颡鱼性别连锁标记Pf62-Y的染色体定位

丹 成1,2王 达1,2桂建芳1

(1. 中国科学院水生生物研究所, 淡水生态与生物技术国家重点实验室, 武汉430072; 2. 中国科学院大学, 北京 100049)

黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco) 隶属鲇形目、科、黄颡属, 广泛分布于我国各大水域, 是我国重要经济鱼类之一。桂建芳等[1]进行了黄颡鱼银染核型研究, 沈俊宝等[2]也报道了黄颡鱼的核型, 其核型为 2 n=52。刘汉勤等[3]利用人工雌核发育等技术开展了全雄黄颡鱼研究,认为黄颡鱼的遗传性别决定类型为XY雄性异配型, Wang, et al. 在黄颡鱼中开展了性别连锁的DNA标记分离研究,筛选得到黄颡鱼雌性和雄性连锁的DNA标记, 由此开拓出一条性别连锁标记辅助的全雄黄颡鱼培育技术路线,用于大规模全雄黄颡鱼的商业生产[4,5]。Pf62-Y作为重要的黄颡鱼雄性连锁标记之一, 我们通过对Pf62-Y的研究,探索黄颡鱼的性别决定与分化机制。

染色体荧光原位杂交(Fluorescent in suit hybriddization, FISH)是以核酸分子杂交技术为基础, 在已有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的非放射性原位杂交技术, 目前已广泛应用于细胞遗传学、分子生物学等各个生物学领域[6]。FISH技术为基因的物理定位提供了一个有力的工具, 该技术也成功地应用于单拷贝顺序的染色体定位。本研究采用 FISH方法将性染色体连锁标记Pf62-Y在染色体上进行定位, 这是首次对黄颡鱼性染色体研究的相关报道。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验用普通雄性黄颡鱼由武汉百瑞生物技术有限公司提供。

1.2 探针制备

基因组DNA抽提 剪取黄颡鱼尾鳍, 蛋白酶K消化组织块, Protein Precipitation Solution去除蛋白, 异丙醇沉淀析出 DNA, 70%乙醇漂洗, 用 100 μL TE缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl, 1 mmol/L EDTA, pH=8.0) 溶解。0.8%琼脂糖凝胶电泳检测 DNA完整性, 分光光度计检测 DNA 纯度和浓度。

探针片段扩增和标记 采用特异引物设计合成和基因组步移技术[7], 我们获得了黄颡鱼 Pf62-Y侧翼 8.1 kb的DNA片段, 并以此作为原位杂交探针。利用缺刻平移法原理。1 μg的 DNA(16 μL)与抗地高辛荧光素标记酶(Cat.No.11 745 816 910, Roche) 4 μL 混合, 15℃反应90min。1 μL 0.5 mol/L EDTA(pH 8.0), 65 ℃ 1 0min 终止反应, –20℃沉淀过夜。

1.3 染色体荧光原位杂交

染色体制片 方法参照Zhu, et al.的报道[8,9], 略有修改。活体注射PHA (10 μg /g鱼体重)100—200 μL, PHA处理 6—8h后注射秋水仙素(0.75%NaCl配制, 4 μg/g鱼体重)溶液处理 2—4h, 取头肾组织用 0.07 mol/L的KCl溶液低渗处理, 用新鲜配置固定液(甲醇∶冰乙酸= 3∶1)固定后, 取出王水处理好的玻片置于冰上, 常规空气干燥法制片, Giemsa染液染色后显微镜下镜检染色体分离相。

探针和染色体制片的变性和杂交 60℃烤片 1h后10 μg/mL胃蛋白酶 37℃消化10min, RNaseA (100 μg/mL) 37℃消化 1h后 2×SSC漂洗, 晾干。72℃的 70%甲酰胺/ 2×SSC的变性液中变性3min, 并迅速移入预冷的70%、95%、100%乙醇中脱水各 5min, 自然干燥。于此同时探针混合液含 50%去离子甲酰胺, 50%硫酸葡聚糖, 20×SSC和 0.25 mg/mL sssDNA, 100 ng标记的染色体DNA, 10% SDS, 于沸水中变性10min, 立即置于冰上至少放置0.5h以上, 使双链 DNA探针变性。冰上搅匀探针,将探针加到变性干燥了的制片上, 盖上盖玻片, 不要有气泡, 于湿盒中37℃避光杂交16—20h。

杂交信号检测 42℃条件下在20%甲酰胺/2×SSC溶液中去掉盖玻片, 然后依次在 2×SSC溶液、0.1×SSC 溶液中强烈洗脱各15min, 1×PBS漂洗5min漂洗3次。每张玻片加50 μL含1%小牛血清的sheep anti-Dig-FITC 抗体(Cat.11207741910, Roche)稀释液, 在湿盒中 37℃温育30—60min, PBS漂洗 3×10min。同样方法加二抗 rabbit anti-Sheep IgG-FITC (Cat. Sc-2779, Santa Cruz)和三抗goat anti-rabbit IgG-FITC (Cat. Sc-2012), 1×PBS漂洗3×10min。用 2 µg/mL 的 PI (Propidium iodide)或者2 µg/mL的DAPI (4’, 6’-diamidino-2-phenylin-dole)染色10min, PBS漂洗3×5min后, 加抗灭剂封片, 激光共聚焦镜检, 拍照。

2 结果

由于制备的中期分裂相所处时期的不同和染色体扩散的差异, 因而仅有部分中期分裂相中显现有杂交信号。我们较详细检测了两尾雄性黄颡鱼的染色体制片, 且每张制片观察分析了65个以上的中期分裂相, 其中期分裂相中杂交信号的检出率为 13.8%—22.6%, 平均检出率为17.3% (表1)。

表1 具有杂交信号中期分裂相的百分率Tab. 1 Percentages of metaphases with hybridized signals

在油镜下观察并拍照分析染色体数目完整、带型清晰的黄颡鱼头肾细胞的中期分裂相。如图1所示, 中期分裂相中的染色体为红色, 仅在一条染色体上显示有黄绿色的杂交信号(箭头所示), 该信号即为Pf62-Y探针在黄颡鱼染色体上的定位。

我们还测量分析了杂交信号所在的染色体(图2), 经测量和统计分析, 该染色体的臂比平均值为 1.4±0.2, 为中部着丝粒染色体; 杂交信号位于其短臂上, 定位于着丝粒的近端。

3 讨论

图1 Pf62-Y在黄颡鱼染色体上的定位Fig. 1 Chromosomal localization of Pf62-Y in yellow catfish

在脊椎动物系统进化中, 鱼类处于承前启后的关键位置。鱼类性别决定往往易受外界环境的影响, 雌雄同体、环境决定型等性别类型在鱼类中也较普遍, 且易发生逆转[10]。具有性染色体的鱼类仅为少数, 并且除经典的XX／XY型, 还有ZW／ZZ等其他类型的性染色体[11,12]。本研究利用FISH技术将Pf62-Y片段探针定位于单一染色体上, 在细胞水平上进一步验证黄颡鱼性别决定类型为XY型, 其杂交显示的染色体即为黄颡鱼的Y染色体。由于观察的各分裂相所处的分裂时期不尽相同, 染色体浓缩程度、构型空间变化不同等, FISH杂交信号会受到染色体内部空间构型动态变化的影响而出现杂信号现象[11]。

总之, 本研究通过黄颡鱼Pf62-Y性别标记的染色体定位, 观察到黄颡鱼 Y染色体的存在, 可见黄颡鱼是研究鱼类性别决定机制和性染色体进化的理想材料, 进一步研究将有可能获得更为重要的进展。

图2 信号所在染色体的结构分析Fig. 2 Structural analysis of chromosomes with the hybridized signal

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[3] Liu H Q, Cui S Q, Hou C C, et al. YY super-male generated gynogenetically from XY female in Pelteobagrus fulvidraco (Richardson) [J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2007, 31(5): 718—725 [刘汉勤, 崔书勤, 侯昌春, 等. 从XY雌鱼雌核发育产生 YY超雄黄颡鱼. 水生生物学报, 2007, 31(5): 718—725]

[4] Wang D, Mao H L, Chen H X, et al. Isolation of Y- and X-linked SCAR markers in yellow catfsh and application in the production of all-male populations [J]. Animal Genetics, 2009, 1365—2052

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CHROMOSOMAL LOCALIZATION OF SEX-LINKED MARKER Pf62-Y IN YELLOW CATFISH

DAN Cheng1,2, WANG Da1,2and GUI Jian-Fang1
(1. State Key Laboratory of Freshwater Ecology and Biotechnology, Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

黄颡鱼; 性别连锁标记; 荧光原位杂交; 染色体定位

Yellow catfish; Sex-linked marker; FISH; Chromosomal localization

Q343.2

A

1000-3207(2014)01-0184-03

10.7541/2014.25

2012-12-03;

2013-10-13

农业部公益性行业科研专项经费(200903046); 淡水生态与生物技术国家重点实验室自主课题(2011FBZ17)资助

丹成(1987—), 男, 江西九江人; 硕士研究生; 主要从事鱼类发育遗传学研究。E-mail: danchengx@163.com

桂建芳, E-mail: jfgui@ihb.ac.cn