研究生细胞电生理实验课设计与实践

范 茁，吴振强

（华南理工大学 生物科学与工程学院，广东 广州 510006）

理论和实践相结合一直是现代化高校办学的宗旨，科学实验可以验证理论并加深对理论知识的理解，在高校生物学科的教学中占有举足轻重的地位［1］。然而目前大多数高校仍然存在教学实验室设备陈旧，而科研实验室的大型仪器对教学领域的开放严重不足等问题，这就导致了学生理论知识的发展更新速度较快，而实验课程因为仪器方面的限制跟进不上的现状［2-3］。例如，在生物学科本科及研究生的教学中，电生理学的知识主要来自于沿用多年的蛙坐骨神经腓肠肌标本的制备及对其神经干动作电位传导的测量，这是组织水平的电生理现象。细胞水平电生理由于其所依托的膜片钳实验系统价格相对昂贵，操作精细、复杂，主要服务于科研领域，一直是高校生物学科实验教学领域的空缺。本文将根据华南理工大学生物科学与工程学院现有的教学和科研条件，阐述利用膜片钳技术为生物学科研究生开设细胞电生理学实验课程的必要性和可行性，并对课程的内容、设置及考核方式进行详细的探讨。

1 为生物学科研究生开设细胞电生理学实验课程的必要性

细胞电生理是组织及机体电生理现象的基础，因为难以检测使之变得更抽象、更难理解。任何一个学科，尤其是生物学科，理论和实验都是相辅相成、互相促进的，理论指导实验的顺利进行，实验又反过来验证理论、使理论知识变得形象易懂。生物学本科生相对粗浅的电生理学知识来自于蟾蜍坐骨神经腓肠肌标本制作及神经干动作电位传导测量等实验课程。研究生阶段对知识的追求更加深入、细致、透彻，细胞电生理学作为理解其他电生理现象的基石，是生物学科研究生教学的重要内容。然而由于仪器操作复杂、样品准备时间较长、实验失败率高等缺点，细胞电生理的实验课程在大多数院校生物学科的教学中一直存在空缺。近年来有些院校开始将细胞电生理和膜片钳技术作为高级生理学课程的一小部分内容，与之配套的实验课程则由于膜片钳实验技术的难度及复杂程度并没有很好地跟进，这就使得学生对离子通道、动作电位等细胞电生理知识的理解处于死记硬背的层面，停留在似懂非懂的状态。由此可见，为生物学科研究生开设与理论知识配套的细胞电生理实验课程非常必要和紧要。

2 为生物学科研究生开设电生理实验课程的可行性

膜片钳技术作为研究离子通道的“金标准”，将细胞水平和分子水平的电生理学研究联系在一起，被人们称为可以和基因克隆技术并驾齐驱的革命性技术，给生命科学研究带来了巨大的前进动力。它自上世纪70年代问世以来，已经发展成为现代细胞电生理学的常规研究方法，广泛应用于细胞生物学、神经科学、药理学、病理生理学、心血管科学、中医药学等研究领域［4-7］。利用膜片钳技术可以在细胞水平记录可兴奋细胞的动作电位及不同成分离子电流、记录单通道及全细胞离子通道电流的动力学特征、研究不同神经元之间的突触联系、观察药物对特异性离子通道电流的影响［8］。

经过几十年的发展，膜片钳技术日趋成熟和完善，研究领域也越来越广。从只能记录一个细胞的单探头放大器发展到可记录不同神经元之间突触联系的双探头、甚至三探头放大器；从独立的系统发展到可以和钙成像、肌张力等系统联用的多功能综合系统；从耗时耗力的常规手动技术发展到高通量的全自动膜片钳技术［9-10］。除此之外，系统外围配件人性化的改进使得膜片钳操作变得更加简单和易控，例如微操系统的自动化以及显微镜和CCD成像系统结合等方面的改进都大大减轻了操作人员的工作量和工作强度。

膜片钳技术在上世纪80年代进入中国，经过几十年的发展，国内有越来越多的专家学者从事电生理领域的研究，培养出一批又一批的优秀人才，他们为膜片钳电生理实验课程的开设提供了人力资源保障。如今膜片钳技术在国内更加普及，越来越多院校的生物学科配置了科研使用的膜片钳系统。总之，膜片钳技术的成熟和硬件系统的完善为细胞电生理实验课程的开设提供了有力的硬件保障。

3 细胞电生理实验课程的设置和考核方式

膜片钳电生理是融合了物理学、电子学、生物学等多学科的综合实验技术，为生物学科研究生开设的细胞电生理实验课要适合生物学科的学生物理学、电子学知识相对不足的特点，对膜片钳技术原理方面的讲解要浅显易懂，侧重于生物学应用相关的内容。下面就这一课程的具体设置和考核方式一一阐述。

细胞电生理实验课包含理论讲解和实验操作2部分内容，理论部分包括：

（1）细胞离子通道的类型，静息电位的形成机制，可兴奋性细胞动作电位的形成机制。

（2）膜片钳技术的发展、原理和应用。

（3）膜片钳技术的4种常见的记录方式。

（4）膜片钳硬件和软件的介绍。

重点和详细地讲解第一和第三部分。第二和第四部分讲解地点最好在放置膜片钳的实验室，对照实物可以使学生更容易理解抽象的内容。实验部分则主要以急性分离的大鼠心肌细胞为研究对象，观测大鼠心肌细胞的静息电位、动作电位和3种主要成分离子电流（Na＋、K＋和 Ca2＋电流）［11-12］。此外将某一种电压门控性离子通道（例如BK通道）转染到传代培养的细胞（CHO或HEK293），可以研究特定种类离子通道单通道和全细胞的特性。

样品准备，尤其是心肌细胞的急性分离需要的时间较长，且容易失败，需要由膜片钳技术人员或者电生理研究室高年级的研究生来完成，但是样品准备的原理和过程要对学生进行讲解，这样可以使学生更容易理解实验的结果。实验操作课程采取观摩和动手操作相结合的方式进行，简单且易于掌控的操作可以由学生完成，难度大的操作如封接、破膜等由教师或技术员完成后给学生看一下结果即可。

实验操作课分4次进行。

第一次课，练习玻璃微电极的拉制和抛光；在显微镜下寻找玻璃电极；电极入水接近细胞等一系列操作。此外利用模拟细胞演示检测全细胞电流的整个操作过程，这一次的实验主要由学生完成，为以后检测真实细胞的动作电位及电流打下基础。

第二次课，检测大鼠心肌细胞静息电位、动作电位和动作电流。大鼠心肌细胞要在上课前准备好，上课时先让学生观察大鼠心肌细胞的形态，选择横纹清楚的细胞进行实验。本次实验课难度高的操作要由教师完成，比如心肌细胞的封接和破膜，破膜后可在教师的指导下由学生进行操作。封接、破膜完成后将电压钳转换为电流钳模式，观测细胞静息膜电位，之后给细胞施加约900pA、5ms时长的脉冲电流，检测细胞的动作电位。动作电流则以之前检测到的动作电位为钳制电压程序，在电压钳模式下进行检测。结合动作电位和动作电流的形状，给学生讲解动作电位形成的离子机制及不同时间段对应的离子电流的方向和成分。

第三次课，检测心肌细胞3种主要离子电流成分。细胞封接、破膜完成后在电压钳模式下检测电流，先在不加任何阻断剂的情况下检测全部成分混合的离子电流，然后用阻断剂结合脉冲电压程序分离出Na＋、K＋和Ca2＋3种不同的离子电流成分。实验完成后，让学生观察和记录3种成分离子电流的特征和幅度。

第四次课，检测转染到HEK293细胞上的BK单通道及全细胞电流。HEK293的传代培养要提前准备好，BK及GFP质粒的共转染在实验课的前一天由实验技术人员完成，让学生选择有绿色荧光的细胞进行实验。和上次一样，细胞的封接、破膜等难度大的操作由教师完成，其他可以交给学生操作。封接完成后，cell-attach模式记录BK单通道电流［13］，之后破膜，记录BK全细胞电流。实验完成后，让学生观察BK单通道和全细胞电流的特征，记录电流幅度。

课程考核采取动手能力和实验报告相结合的方式，动手能力主要看学生实验操作掌握的快慢程度和准确程度、有没有严重的操作错误，实验报告则针对实验结果图形、数据及课后思考题的回答等给予评分。

4 总结和讨论

本文阐述了为生物学科研究生开设细胞电生理课程的必要性、可行性以及课程具体的设置和考核方式。细胞电生理是生物体可兴奋组织电生理现象的基础，如心肌的搏动、神经的冲动等都是依赖于单个细胞的电生理特性的。依托于膜片钳技术的电生理实验课程可以弥补学生在细胞电生理实验方面的不足，辅助其理解抽象的理论知识。因为膜片钳技术专业性强、操作复杂，样品的前期准备也耗时耗力，所以细胞电生理的实验课程不适合为理论知识和实验技能相对薄弱的本科生开设，而作为加强型课程为对此领域感兴趣的研究生开设则有助于其提高实验技能、拓展知识面、增强创新能力。

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