多肽检测方法研究进展*

栾崇林，蒋晓华，金 刚，代建国

（深圳职业技术学院 应用化学与生物技术学院，广东 深圳 518088）

多肽检测方法研究进展*

栾崇林，蒋晓华，金 刚，代建国

（深圳职业技术学院 应用化学与生物技术学院，广东 深圳 518088）

本文对质谱法（MS）、液相色谱质谱联用法（LC-MS）、毛细管电泳质谱联用（CE-MS）法、光谱分析法等在多肽检测中的最新进展进行了综述．质谱检测多肽最大的优势在于稳定性、重现性好，准确性高．采用色谱或电泳分离技术与质谱联用可解决相同氨基酸组成但序列不同的多肽的检测．光谱技术检测多肽，通常无需样品预处理分离，且光谱技术设计的多肽传感方式灵活多变，但光谱技术往往需要借助其他方法才可对多肽进行定性分析，因此该方法不具有普遍性．

多肽；质谱；色谱；荧光；检测

多肽通常是指由10~100个氨基酸分子脱水缩合而成的化合物．也有文献将2~10个氨基酸组成的肽称为寡肽，10~50个氨基酸的组成的肽称为多肽，50个以上氨基酸组成的肽称为蛋白质[1]．多肽种类繁多，几乎参与生物体的生长、发育、免疫、新陈代谢等各个环节，如促进矿物质吸收的肽（CPPS）、酶调节剂（如促胰酶肽）、激素肽（如生长激素释放因子GRFS）等[2]．多肽作为生物标志物还涉及到某些疾病的病理研究，如 β淀粉样肽在脑中的沉积与阿尔兹海马病密切相关[3-6]，血清多肽对于一些恶性肿瘤的诊断也很有帮助[7]．除此以外，某些动物在受到外界刺激时，会产生大量的具有抗菌活性的多肽，这些多肽不仅具有很强的杀菌能力，有的还可杀死肿瘤细胞[8]，这类特殊的多肽被称为抗菌肽，目前并已被应用于食品、饲料添加剂及药物的开发等．本文根据检测技术的分类，对检测多肽的新方法研究进展进行综述，并对多肽检测领域的发展前景进行展望．

1 质谱法及其联用方法

用质谱所检测出的多肽质量谱图，通常被称为指纹图谱．质谱检测的多肽最大的优势在于稳定性、重现性好，准确性高．目前将质谱技术应用于多肽检测主要有基质辅助激光解吸飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）方法、液相色谱—质谱联用(LC-MS）方法以及毛细管电泳-质谱联用（CE-MS）方法．

MALDI-TOF-MS法所用仪器主要由2部分组成：基质辅助激光解吸电离离子源（MALDI）和飞行时间质量分析器（TOF）．MALDI的原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给生物分子，电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，而使生物分子电离．TOF的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测，即测定离子的质荷比（M/Z）与离子的飞行时间成正比．MALDI-TOF-MS法具有灵敏度高、准确度高、分辨率高及自动化程度高、分析速度快等特点，而且能满足多肽组学和蛋白组学高通量检测分析的要求．然而MALDI-TOF-MS法对多肽检测时，它仅对含精氨酸的多肽有较高的精确度．2000年，Hale课题组提出将赖氨酸上的ε氨基修饰O-甲基异脲，使其变成高精氨酸，这样使得赖氨酸也很容易被检测到，此方法大大提高了检测胰蛋白酶分解的多肽片段的灵敏度，并对于含有很高的（赖氨酸/精氨酸）含量比值的多肽的检测非常有效[9]．2010年，Wu课题组首次报道了将半胱氨酸修饰的 Mn2+掺杂 ZnS纳米颗粒（即Mn2+-doped ZnS@cysteine NPs）作为基质，用MALDI-TOF-MS检测多肽的方法[10]．与其他的基质相比，如ZnS NPs、Zn@Cyseine NPs以及α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA），在水相中合成的该Mn2+-doped ZnS@cysteine NPs纳米基质在检测小分子多肽方面以及在检测灵敏度方面更具优越性，并且此方法成功应用到了尿样中多肽混合物的检测．随后，2011年Lie课题组研究出了简单、灵敏、高通量的用MALDI-TOF-MS检测多肽的新方法，他们通过将量子点加入基质中使其得以改善，检测多肽及混合物时，灵敏度大大提高[11]．

以上2种方法均是通过改善基质来提高多肽检测的灵敏度．也有研究者通过改善样品前处理过程，以达到提高检测灵敏度的目的．2012年，Nadnudda等人设计了一种非常灵敏的用MALDI-MS法检测血清中多肽的新方案，他们利用正电或者负电两性均聚物形成反向胶束，对预先除去HSA和IgG的血清中的低丰度多肽如血管缓激肽、C4a、ITIH4等以及生物标志物前列腺抗原（PSA）分别进行选择性的预富集处理，再利用MALDI-MS对经过预富集处理后的样品进行检测，灵敏度大大增强，检测血管缓激肽、C4a、ITIH4检出限分别为0.5、0.08、0.2 ng/mL，PSA的检出限为0.5 ng/mL[12]．2013年，Lai课题组着重于改善MALDI-TOF质谱法的免疫共沉淀的预处理步骤，设计了一种非常灵敏的检测淀粉肽β1-28的新方法，并实现了其在人血浆中灵敏度低至6.14 pm的检测[13]．他们通过提高抗体与小分子多肽的亲和力，对其在复杂的人血浆基质中进行预富集．合成含有6E10和4GB两种淀粉肽β1-28单克隆抗体组合而成的F(ab’)-(PEG)24小球，通过两种抗体对目标多肽的共同的亲和作用力将其分离，使得检测灵敏度大大增强．

除以上的一些方法以外，也有研究者对某些含有特殊氨基酸的多肽进行了检测．有数据表明97%的蛋白和17%的多肽片段都含有半胱氨酸，因此若能提高半胱氨酸的检测灵敏度便能提高质谱低丰度蛋白、多肽检测灵敏度．2012年Shimada等人设计了 6种半胱氨酸的标记物，大大提高了MALDI-TOF-MS检测含有半胱氨酸的多肽的检测灵敏度，从而也提高了亲水性多肽、低丰度多肽的检测灵敏度[14]．

然而，质谱在检测具有相同氨基酸组成但序列不同的多肽时，由于它们具有相同的分子量，给出等同的分子离子峰，因此不能满足多肽结构的解析工作．采用色谱或电泳分离技术与质谱联用是解决这一问题的很好途径．2003年，Thomas等人将液相色谱法与质谱联用，实现了血管紧张肽Ⅱ、铃蟾肽、缓激肽、黑化诱导神经肽、神经降压肽和P物质等多种多肽的检测，检出限低至1 ng/mL，线性范围1-100 ng/mL，并随后用质谱实现了含氯水中的多肽氧化产物的定性检测[15]．2005年，Karine等人发展了一种将高场非对称波形离子迁移谱（FAIMS）与纳米液相色谱-质谱（nanoLC-MS）结合的方法，即nanoLC-FAIMS-MS，该法可从复杂的胰蛋白酶水解物中灵敏而选择性地检测多电荷的肽离子．FAIMS技术作为一种气相离子分离技术，可以减少化学噪音，增强多肽的检测信号，与传统的nanoLC-MS技术比，信噪比提升了6~12倍，可检测出的多肽的数量提升了 20%[16]．2006年，Mario等人利用LC-MS技术实现了人类尿液中兴奋剂胰岛素类似物的灵敏检测，他们将固相微萃取技术与免疫亲和纯化技术结合，从而实现了人类尿液中目标物的浓缩富集和分离，随后利用在线质谱进行定性，然后再通过LC-MS技术对赖脯胰岛素（Humalog LisPro）、门冬胰岛素（Novolog Aspart）以及赖谷胰岛素（Apidra Glulisine）进行了定量分析，检出限低至0.05 ng/mL (9 fmol/mL)[17]．2009年，Andreas等人也利用LC-MS实现了人类尿液中二十四肽促皮质素的检测，他们用表面覆盖抗体的磁性小球对目标物进行磁分离（免疫亲和纯化技术）预富集处理，随后用LC-MS进行定性定量分析，最后实现了尿样中目标物二十四肽促皮质素的检测，检出限低至3 pg/mL[18]．2009年，刘丽红等建立了一种氨基酸组成相同序列不同的多肽的LC-ESI-MS分析新方法．在反向色谱模式下，2种小分子三肽Gly-Phe-Ser和Gly-Ser-Phe实现了较好的分离，实验证实，流动相组成及pH值对分离行为及检测灵敏度具有重要影响，在以20mmol/L乙酸铵-水-乙腈（50:45:5，V/V/V）作为流动相在pH7的条件下洗脱，该方法重现性好、准确度高、灵敏度高．此方法的建立对其他此类氨基酸组成相同序列不同的蛋白质及多肽的分离分析具有参考意义[19]．

与HPLC相比，毛细管电泳（CE）的分离效率更高、上样量更少，是一种灵敏的多肽检测方法．周国华等以血管紧张素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、P-物质和生长激素抑制剂混合物为测定对象，用CE-ESI-MS法分离鉴定了5种生物活性肽．pH为5.0和4.5的NH4Ac缓冲液能在LPA涂层柱和胺涂层柱上很好地分离上述5种肽类混合物．在选择的离子检测模式下，检出限（3δ）分别约为193、240、804、153和185 fmol，测定相对误差（%）分别为0.015、-0.067、0.064、-0.031和0.074[20]．Varesio E.等建立了一种测定人血浆中 amyloid-β肽（Mr=4330.0，40个氨基酸）的CE-MS方法．并利用柱切换技术克服了毛细管柱底灵敏度，不易进行体内低浓度样品测定的缺点．采用HP1100 MSD单级四级杆质谱，选用ESI离子源，正离子检测，采用SIM模式．最低检测限为50ng/mL[21]．

2 多肽荧光光谱分析法

荧光光谱多肽分析法通常通过体系中多肽的含量所引起的体系荧光强弱的变化而实现多肽的检测．2009年，Hamachi课题组设计了一种新型的针对双磷酸化多肽的荧光探针 1-2Zn()Ⅱ，实现了 10-6mol/L双磷酸化多肽的检测．现有的2-2Zn( )Ⅱ探针对于不同位点磷酸化(i, i + n)的多肽都能检测，但选择性较差，而 1-2Zn()Ⅱ探针专门针对双磷酸化位点为（i, i+1）的多肽，因此与现有的双磷酸化多肽探针 2-2Zn()Ⅱ相比，性能更优越，选择性更好[22]．2010年，Lim等人合成了一种选择性检测半胱氨酸或者含 N-端半胱氨酸残基多肽的荧光探针，该探针为不饱和醛基功能化的发色团，该物质与含巯基的半胱氨酸或者半胱氨酸残基反应后的生成物，可产生强烈的荧光，即产生与目标物相关的“turn-on”模式的信号响应[23]．近些年，随着荧光共振能量转移（FRET）火热发展，FRET技术已经广泛应用到了各类生物和化学物质的分析检测之中[24-27]，多肽的检测也不例外．2012年，Takahashi等人设计出了一种可检测淀粉体多肽Aβ1-42的蛋白，并将其命名为CPYAB4，由荧光供体蓝绿色荧光蛋白 CFP、荧光受体黄色荧光蛋白YFP以及连接序列GGS三部分构成．体系中不含目标物情况下，CPYAB4发生分子内的FRET效应，CFP荧光有效猝灭，荧光强度极弱；当体系中含有目标物淀粉体多肽Aβ1-42时，CPYAB4与其发生反应，结构发生变化，CFP与YFP之间距离发生变化，于是阻碍了CPYAB4分子内的FRET效应，CFP的荧光不能被有效猝灭，体系荧光大大增强，其增强程度与Aβ1-42的浓度密切相关[28]．

除了上述利用荧光方法检测多肽以外，其他的一些光谱技术也逐渐深入到多肽检测的领域中来．例如，在2005年Xie等人用拉曼光谱来表征氨基酸，通常磷酸化的氨基酸和多肽由于–OPO32-与–OPO3H-的存在随着体系pH的变化而变化，而拉曼光谱中，980 cm-1和 1080 cm-1处的磷酸丝氨酸带（–OPO3H-）和磷酸苏氨酸带（–OPO32-）容易受临近基团的影响，从而为磷酸化的氨基酸和多肽的表征带来了困难，于是 Xie等人利用 drop coating deposition Roman（DCDR）方法很好地解决了以上问题，顺利地对不同pH体系中的磷酸质子化的多肽和氨基酸进行了表征[29]．另外，在 2010年，Mustafa等人利用椭圆偏振光谱测量的内部全反射模式（TIRE）检测β-淀粉样肽Aβ（1-16），在该法中，利用Aβ（1-16）以及其单克隆抗体DE2直接免疫反应而形成的复合物静电吸附于金表面，从而实现了β-淀粉样肽（1-16）在0.05 ng/ml ~ 5 ug/ml范围内的免标记检测[30]．随后在2011年，Wang等人设计了一种共振光散射检测β-淀粉肽1-42的方法．基于纳米金聚集后产生更强的光散射信号，目标分子的出现会引起纳米金的聚集状态．当体系中没有Aβ1-42时，预先存在的Zn2+首先会引起生物素修饰的Aβ1-16聚集，亲和素修饰的纳米金也因表面的亲和素与生物素间较强的作用而产生聚集，因而产生很强的共振光散射信号；体系中含有Aβ1-42时，Zn2+与 Aβ1-42 作用力更强而优先与之发生反应，使得之前的纳米金聚集反应无法顺利进行，共振光散射信号明显减弱，其信号减弱程度与目标物Aβ1-42的浓度密切相关[31]．

总之，利用光谱技术检测多肽，通常无需复杂的样品前处理分离技术，且光谱技术设计的多肽传感器灵活多变，适用于各种不同体系下的多肽检测．

3 其他多肽检测法

Hou等发展了一种简单、快速，超灵敏的检测生物素修饰的多肽的方法[32]．该方法首先将生物素修饰的多肽固载于硝化纤维膜上，通过抗体与生物素之间的反应，抗体修饰的纳米金发生反应后形成红点，红点的强度通过Quantity One（一种定量分析软件）记录．检出限低至100 amol，检出范围是1pmoL~1μmol．随后用银进行信号放大，灵敏度低至100 zmol，检出范围100 zmoL~100 fmol．再如，Brambilla等人将毛细管电泳与激光诱导荧光结合（CE-LIF），有效地检测并监控了β-淀粉样多肽与聚合纳米颗粒的相互作用，为CE-LIF法的开发提供了一定的实验和理论基础，开辟了新的研究前景[33]．Kawulka 等采用同位素标记技术，以13C、15N 标记化合物的核磁共振（NMR）新技术测定了一种分离自一种细菌Bacillus subtilis 中新的抗微生物多肽Subtilosin A的结构，最新出现的HPLC-MS-NMR联用集合了HPLC-MS 与HPLC-NMR 这两种联用技术的优点，使得在线获得更多的多肽产物样品的结构信息成为可能[34]．Louden 等以D2O 为流动相在线联用HPLC-UV-IR，-HNMR-MS技术分离分析了Sileneotites，Silenenutans，Silenef rivaldiskyana的提取物中的20 种蜕皮激素和蜕皮类固醇[35]．杨茜璐等建立了一种非探针标记型磷酸化多肽的电化学检测方法，该方法以N，N-二（羧甲基）–L-赖氨酸（Lys-NTA）和Fe3+修饰的金电极作为磷酸化多肽的捕获和传感界面，利用磷酸化多肽能够与之形成金属离子螯合物而发生特异性结合并引起电极表面修饰层通透性改变等特点，采用铁氰化钾作为电化学指示剂，用循环伏安法和交流阻抗法对磷酸化多肽的结合进行表征和检测．磷酸化多肽浓度在5~75 μmo l/L时，循环伏安图中峰电流随着磷酸化多肽浓度的增大而增大，而非磷酸化多肽不能引起峰电流变化[36]．

4 展 望

研究者已经开发出多种依赖不同的检测技术的多肽检测方法，并已经成功实现了多肽超高灵敏性，高选择性的检测，并为生物医药、临床病理论等方面的研究提供了强有力的支持．然而，很多多肽片段因其分子量小，结构普通，对它们的在复杂基质中（如尿液，血浆等）超痕量的检测仍然存在着巨大的挑战，多肽检测方法的开发仍然还有很大的探索空间．尤其是电化学方法作为新兴的多肽检测方法，具有所用仪器简单、灵敏、快速等特点，是一个很有发展潜力的分析技术．

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Peptide Detection: A Brief Review

LUAN Chonglin, JIANG Xiaohua, JIN Gang, DAI Jianguo

（School of Applied Chemistry and Biotechnology, Shenzhen Polytechnic, Shenzhen, Guangdong 518055,China）

In this paper, a review was made on study of mass spectrometry, liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS), capillary electrophoresis-mass spectrometry (CE-MS), spectroscopic method and other approaches in detection of polypeptide. Mass spectrometry approach is characterized by good stability，reproducibility and accuracy. LC-MS or CE-MS can detect polypeptide with the same amino acid composition but different sequence of amino acid. Spectrometry can detect Polypeptide with great flexibility to transduce the detecting signals without sample pretreatment and separation, but it cannot conduct a qualitative analysis of polypeptide, which limits its wide application.

peptide; mass-spectrum; chromatograph; fluorescence; detection

O656.31

A

1672-0318（2014）05-0054-06

10.13899/j.cnki.szptxb.2014·05, 011

2014-01-15

*项目来源：深圳市基础研究计划资助项目（No. 20120531204110）

栾崇林（1965-），山东人，博士，教授，主要研究方向：电化学传感技术．