不同品种香蕉内生菌分离及广谱拮抗菌的筛选

王梦颖周登博井涛胡一凤高祝芬谢晴宜张锡炎戚春林

（1.海南大学环境与植物保护学院，海口 570028；2.中国热带农业科学院生物技术研究所，海口 571101；3.中国热带农业科学院海口试验站，海口 570102）

不同品种香蕉内生菌分离及广谱拮抗菌的筛选

王梦颖1，2周登博2井涛3胡一凤1，2高祝芬2谢晴宜2张锡炎2戚春林1

（1.海南大学环境与植物保护学院，海口 570028；2.中国热带农业科学院生物技术研究所，海口 571101；3.中国热带农业科学院海口试验站，海口 570102）

旨在探究抗病品种与易感品种香蕉的健康株和病株内生菌与其中广谱拮抗菌的主要分布规律，并对广谱拮抗菌进行拮抗活性的测定。以样品根、球茎、假茎、叶为材料分离培养内生菌，在实验室条件下，筛选对供试的10种香蕉致病菌均有良好拮抗活性的菌株并测定它们的拮抗活性，对活性最强的菌株进行形态学、16S rDNA序列同源性分析。结果显示，分离得到内生菌438株，其中细菌240株，放线菌142株，真菌56株。抗病品种南天黄病株中分离得到的内生菌最多，共计128株。内生菌数量在香蕉植株中的分布呈现规律为：根部＞球茎部＞假茎部＞叶部。内生真菌在各香蕉种病株中的分布最广泛。筛选出具广谱活性的放线菌10株、细菌2株。其中内生放线菌菌株041的广谱拮抗活性最强，最大抑菌带宽为28.13±1.89 mm。对广谱拮抗内生放线菌菌株041、04-1、19-1、03A-1进行的形态学和16S rDNA序列分析表明，它们属于链霉菌属。

香蕉 内生菌 广谱拮抗菌 分离

香蕉是世界贸易量及消费量最大宗的鲜果，被联合国粮农组织（FAO）定位为发展中国家仅次于水稻、小麦、玉米之后的第四大粮食作物［1］，是我国南方四大名果之一，也是我国内消费和出口创汇的重要资源，经济地位极其重要。海南是香蕉的主产区，香蕉是其优势产业，在其水果种植业中占有很重要的位置［2］。然而香蕉种植区气候普遍潮湿高温，易发生病害，多发的香蕉病害轻则造成香蕉果实品质和产量降低，重则对香蕉的生产造成毁灭性打击。由于大量频繁使用农药会破坏生态平衡、增加香蕉果实内农药的残留量，因此寻找有效的控制香蕉病害的生防菌对于香蕉生产十分重要。

植物内生菌是在植物组织内与植物共生的一类微生物，它们具有在植物体内独立自主地分裂繁殖和传递的特性，成为生物防治中有潜力的微生物农药和增产菌，因此分离并利用作物的内生菌控制作物的病虫害、开发有益内生菌以提高作物产量和品质对于可持续性农业具有重要意义［3，4］。本研究采用严格的表面消毒程序，从健康与感病香蕉的根、球茎、假茎、叶内部分离出内生细菌、真菌、放线菌，并且针对微生物农药具有单一性的不足，从广谱拮抗方面对香蕉内生菌进行筛选，旨在为这些内生菌株的进一步利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试植物材料 海南省临高县南保镇、皇桐镇蕉园采集易感品种巴西蕉、抗病品种农科一号、抗病品种南天黄健康株和病株的根、球茎、假茎、叶。1.1.2 供试病原菌 香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporumf. sp.Cubense）4号生理小种（FOC4）和1号生理小种（FOC1）、香蕉大灰斑病菌（Curvularia lunata）、香蕉长形斑病菌（Curvularia fallax）、香蕉棒孢霉落叶病菌［Corynespora cassiicola（Berk&Curt）Wei］、香蕉叶缘枯斑病菌（Alternaria musae）、香蕉果尖腐烂病菌（Deightoniella troulosa）、香蕉炭疽病菌（Colletotrichum musae）、粉蕉叶枯病菌（Pestalogiopsissp.）、香蕉树木溃疡病菌（Btoryosphaeria dothidea），均由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所提供。

1.1.3 供试培养基 高氏一号合成培养基，Yeast Extract with supplements（YE）培养基，Potato Dextrose Agar（PDA）培养基，马丁培养基，LB培养基。

1.2 方法

1.2.1 香蕉各组织内生菌选择性分离培养

1.2.1.1 样品表面消毒与检测 采用改进的阮继生［6］的样品表面消毒方法，表面消毒检测采用常规印迹法［7］。

1.2.1.2 内生细菌的分离、纯化与保藏 无菌研磨样品后无菌水震荡过夜，取10-4和10-5稀释液涂布于LB平板，选取代表菌划线纯化，挑取单菌落于LB斜面上和终浓度为20%的甘油中，保藏于-80℃。

1.2.1.3 内生放线菌的分离、纯化与保藏 无菌研磨处理样品，然后分别加入3 mL预培养液（N-ZAmine 0.2 g/L的pH7.0磷酸盐缓冲液）震荡培养后涂布于分离平板［6］1/10ATCC172、SIM、HV、GA、GPT、高氏培养基。代表菌株采用三步划线法［3］划线到YE平板上获得单菌落，于YE培养基斜面上划线接种，保藏于-80℃。

1.2.1.4 内生真菌的分离、纯化与保藏 无菌研磨样品取10-3和10-4稀释液涂布于马丁培养基，待长出后选取代表菌株划线到PDA平板上，挑取单菌落于PDA培养基斜面上划线接种，保藏于-80℃。

1.2.2 内生菌株的广谱拮抗活性测定

1.2.2.1 广谱活性菌株的筛选 香蕉枯萎病FOC4拮抗菌的初筛采用平板对峙法［7］，再以香蕉炭疽病菌、香蕉大灰斑病菌、香蕉长形斑病菌、香蕉棒孢霉落叶病菌、香蕉叶缘枯斑病菌等9株香蕉病原真菌为靶标菌，用平板对峙划线法［8］对初筛菌株进行广谱拮抗活性测定。

1.2.2.2 广谱拮抗菌株抗香蕉枯萎病FOC4活性测定 采用浇混平板法［9］，用黄豆粉发酵培养基［10］震荡培养一周，将10%的上清滤液加入PDA培养基均匀混合，倒入平板，在每个平板中接入FOC4菌块，发酵液活性高的菌株将会抑制病原菌的生长。

采用孢子萌发法［11］，在无菌条件下将FOC4孢子悬液用无菌水稀释到1×107CFU/mL，按发酵液与FOC4孢子悬液1∶1混合至凹玻片内混匀，以液体PDA培养基处理为对照，对照孢子萌发率达80%时观察孢子萌发情况。

孢子萌发率（%）=［（对照萌发率-处理萌发率）/对照萌发率］×100%

1.2.3 菌株041、04-1、19-1、03A-1的形态学鉴定与16S rDNA序列分析以及系统发育树构建

1.2.3.1 形态学鉴定 采用平板插片法［8］并加以改进，用扫面电子显微镜观察孢子形态。

1.2.3.2 16S rDNA序列分析以及系统发育树构建菌株041、04-1、19-1、03A-1的基因组DNA提取并进行PCR扩增。扩增引物为细菌的16S rDNA通用引物。PCR产物由上海生工生物工程有限公司完成序列测定。测定的序列在GenBank中做BLAST比较，选取相似序列与目标序列比对，生成MEGA5.05格式文件，用生成的多序列比对结果文件构建Neighbor-Joining树，并进行Bootstrap分析。

2 结果

2.1 香蕉各组织内生菌选择性分离培养

表面消毒检测：将印迹平板于28℃下培养2周后观察无菌生长，证实分离到的438株代表菌株均为内生菌。

2.1.1 不同香蕉品种内生菌分布 如图1所示，内生菌分布最多在抗病品种南天黄病株中，共计128株；其次分布最多在易感品种巴西蕉健康株中，共计118株；分布最少在抗病品种农科一号中，共计49株。内生菌数量在各品种中的分布呈现南天黄病株＞巴西蕉健康株＞巴西蕉病株＞南天黄健康株＞农科一号健康株的规律。此外，易感品种巴西蕉健康株的内生菌多于病株，而抗病品种南天黄病株的内生菌多于健康株。

2.1.2 各组织中内生菌分布 以分离的菌株形态特征、颜色特征和表面纹理各不相同的代表菌株为统计分析依据。各组织内生菌的数量与种类分布总体呈现根部＞球茎部＞假茎部＞叶部的规律。如图2所示，5个香蕉品种中，南天黄病株各组织的内生菌数量变化差异最显著，如在内生菌分布最丰富的根组织中，南天黄病株的内生菌最多，共61株，但其叶中内生菌仅6株；巴西蕉健康株的内生菌在根部共计36株、球茎39株、假茎19株、叶部26株，可见其内生菌分布相对丰富且各部位总体呈现均匀分布；巴西蕉病株内生菌虽相对较少，但各组织内生菌也呈现均匀分布。抗病品种农科一号健康株根部内生菌共35株，也与茎（4株）、叶（3株）内生菌分布数量差异显著。

2.1.3 内生细菌、放线菌、真菌在各香蕉品种间的分布 试验结果表明，香蕉的根、球茎、假茎、叶中均有内生细菌、放线菌和真菌的存在。经预培养，共分离得到438株内生菌，其中细菌数量最多，其次是放线菌，真菌最少。内生细菌在巴西蕉健康株中分布最多（图3-A），内生放线菌在南天黄病株中分布最多（图3-B）。内生真菌大多为致病菌，其在巴西蕉病株数量最多（图3-C），且各香蕉品种中的内生真菌数量在健康株与病株中呈现病株多于健康株的分布。如图3-A所示，内生细菌共计240株，占内生菌分离总数的55%。其中巴西蕉健康株中分布最多，共67株；农科一号健康株中分布最少，共23株。从各组织分布看，内生细菌在植株根中分布最多，共78株；假茎中分布最少，共46株。此外，易感品种巴西蕉内生细菌数量分布是健康株＞病株，而抗病品种南天黄中内生细菌数量分布是健康株＜病株。通过ATCC、SIM、HV、GA、GPT和高氏一号培养基选择性分离培养，共分离内生放线菌142株，占内生菌总数的32%。如图3-B所示，南天黄病株中分布最多，共51株；巴西蕉病株中分布最少，共7株。从组织分布看，内生放线菌在植株根组织中分布最多，共68株；叶组织分布最少，共7株。此外，易感品种巴西蕉内生放线菌数量分布呈现健康株＞病株的现象，而从抗病品种南天黄

2.2 内生菌株的广谱拮抗活性测定

2.2.1 广谱拮抗菌株的筛选 筛选出具有较好抗香蕉枯萎病FOC4的活性菌株29株，抑菌率最大可达到98%，占内生菌分离总数的7%。其中放线菌15株，细菌12株，真菌有2株具有抑菌活性，但效果不显著。筛选出对香蕉炭疽病、香蕉果尖腐烂病等9种香蕉致病真菌具有广谱拮抗活性菌株12株。这些拮抗菌主要分布于易感品种巴西蕉健康株和抗病品种南天黄病株的根部与茎部（表1）。

表2显示，内生放线菌菌株04-1、041、19-1和03A-1抑菌活性显著，抑菌宽度最大为28.7 mm，抑菌率最高为98%；菌株19-1和03A-1均对香蕉棒孢霉落叶病Cc-013的抑菌活性显著，但19-1对粉蕉叶枯病A-1和香蕉枯萎病FOC1抑菌活性弱且差异显著，03A-1对香蕉长形斑病L-1的抑菌活性弱，抑菌宽度仅为1.40±1.25 mm；菌株04-1和041对香蕉大灰斑病CW抑菌活性显著，并且广谱抑菌活性总体大于菌株19-1与菌株03A-1。健康株共分离内生放线菌12株，从其病株中却分离到51株，远比健康株丰富。如图3-C所示，内生真菌共计56株，占内生菌分离总数的13%。其中，巴西蕉病株中分布最多，共21株；南天黄健康株和农科一号健康株中分布最少，共6株。从组织分布看，内生真菌在假茎中分布最多，共计23株；球茎中分布最少，共计3株。此外，易感品种巴西蕉和抗病品种南天黄的内生真菌数量分布都呈现健康株＜病株的现象。

2.2.2 广谱拮抗菌株抗香蕉枯萎病FOC4的活性测定 广谱拮抗菌041、04-1、19-1和03A-1的发酵滤液对FOC4均有明显抑菌效果，其中04-1和041对FOC4的菌丝生长抑制作用最强，抑菌圈直径最大为25.80 mm。孢子萌发法测定发现4株菌的发酵滤液对FOC4的孢子萌发具有较强的抑制效果。发酵滤液与FOC4孢子悬液的体积比为1∶1时，FOC4的孢子萌发率最低，仅为9.85%。

2.3 菌株041、04-1、19-1、03A-1的形态学鉴定与16S rDNA序列分析以及系统发育树构建

2.3.1 形态学特征 光学显微镜和扫描电子显微镜观察（图4）发现，菌株19-1孢子链直，孢子排列紧密整齐，孢子呈柱形或卵圆形，中央凹陷；菌株041和041孢子链呈紧密螺旋形，孢子球形或长圆形，中央凹陷；菌株03A-1孢子链直，孢子椭圆形至短柱形，中央凹陷。

2.3.2 16S rDNA序列分析以及系统发育树的构建将菌株041、04-1、19-1和03A-1分别进行16S rDNA序列测序，其GenBank登录号依次为：KF703552、KF703550、KF703551和KF703549。在EzTaxon与GenBank上进行序列相似性分析，用MEGA 5.05中Neighbor-Joining法比较同源性并构建系统进化树。结果（图5）显示，菌株Streptomycessp. 19-1靠近Streptomyces antibioticu（同源性为98.34%）；Streptomycessp. 041和Streptomycessp. 04-1都与S. phaeoluteichromatogenes和S. misionensis靠近，同源性分别是98.89%和98.14% 与98.60%和98.72%；Streptomycessp. 03A-1靠近Streptomyces cellostaticus（98.25%）、Streptomyces yokosukanensis（98.10%）和Streptomyces griseochromogenes（98.23%），但与S. griseoruber同源性最高（98.76%）。16S rDNA序列分析与系统发育分析表明这些菌株均属于链霉菌属。它们确切的分类地位需要进一步的试验，如DNA-DNA杂交确定。

3 讨论

香蕉枯萎病是一种土传病害［14］，也是香蕉最重要的病害，曾在中、南美洲毁灭大片蕉园。该病害现广泛分布于南太平洋、亚洲、澳大利亚、非洲、及美洲热带的香蕉产区［15］，我国广东、广西、福建、台湾［16］和海南［17］等省（区）均有分布，灾害惨重。其中，香蕉枯萎病4号生理小种即FOC4自1967年在我国台湾发现后，短短的10年时间内，几乎摧毁了台湾的香蕉产业，使台湾香蕉栽培面积自高峰时期的50 000 hm2锐减到20世纪90年代的6 000 hm2左右［26］。本研究以内生菌对香蕉枯萎病菌FOC4拮抗活性作为初筛标准，筛选出抗FOC4的活性菌株，接着再对这些菌株做包括香蕉枯萎病FOC1在内的其它9种香蕉致病菌的广谱拮抗活性筛选，并对筛选出的广谱活性菌再一次做抗FOC4活性测定，旨在选择对香蕉枯萎病有较好拮抗活性的广谱性拮抗菌。采用香蕉内生菌作为筛选生防菌的对象，因其本身就存在于香蕉体内，容易占据有利的生防位置，可以经受住植物自身的防卫反应，与病菌直接相互作用，从而给植物提供全面有效的保护［27］。最终筛选出的12株内生广谱拮抗菌对10种香蕉病原菌均有较好的抑菌活性，其中编号为041、04-1、19-1和03A-1的内生放线菌对香蕉枯萎病菌抑菌活性最强。目前从微生物中发现的8 000多种微生物活性物质中，有近70%是放线菌产生的，放线菌是产生抗生素的主要生物类群。一般来说，放线菌产生的抗生素都有强大的抗菌力，起抗菌作用的抗生素许多是广谱的，有的还有抗霉菌的作用［3］。在本试验中，共选用6种放线菌的选择性分离培养基以确保分离尽可能丰富的放线菌。虽然分离结果显示内生细菌为香蕉植株的优势内生菌，但最后经筛选的活性较强的4株广谱拮抗菌均为放线菌链霉菌属。迄今已发现能抑制作物病原菌的放线菌素28种，其中13种已商品化生产，2种正处于试产阶段［28］。本研究对具活性的内生放线菌进行形态学与分子学鉴定，旨在进一步对其开发利用。

香蕉不同品种对香蕉枯萎病具有不同的抗性。这种抗性是否与抗感品种的内生菌有关，以及抗感品种间是否存在内生菌多样性和种群结构的差异，目前尚未见报道。对不同抗感品种、以及植株各部位内生菌多样性和群落结构的了解，对于香蕉病害的发生和防控具有重要的意义。本研究结果表明，内生菌数量在各品种中的分布呈现南天黄病株＞巴西蕉健株＞巴西蕉病株＞南天黄健株＞农科一号健株的规律。总的来说不同寄主植物的抗病机理有3种：形态结构方面的物理抗病性（physical resistance）、生理生化方面的化学抗病性（chemical resistance），或者是两者相互作用的共同抗病性［19］。其中，在化学抗病方面，主要研究集中在寄主受到病原菌侵染后体内一系列的酶促反应的进行上。本试验中抗病品种南天黄的病株内生菌为124株，是内生菌分布数量最多的品种，并且其内生菌数量是健康株中的一倍。分离还发现，南天黄病株根部与叶部的内生菌数量悬殊，且具拮抗活性的菌株均集中在南天黄病株的根部，这可能就是由于抗病品种的抗病性在土壤习居病原菌侵入根部后产生的一系列化学反应，致使植株体内微生物数量增加，其中根部最多。此外，结果对比还发现易感品种巴西蕉健康株中的内生菌数量为118株，在各品种内生菌分布数量上位居第二，并且其健康株中的内生菌数量要远多于病株。从植物微生态角度分析，植物微群落中，微种群数量越多则多样性越高，植物生态系的功能与结构越稳定，越不易感病［15］。另外，内生菌数量在样品香蕉中的整体分布呈现：根部＞球茎部＞假茎部＞叶部，该结果与付业勤［12］的报道基本一致，所不同之处在于本研究对香蕉植株的球茎组织也进行了分离处理，更全面地反映了香蕉内生菌在各组织中的分布情况。此外，刘云霞［13］的研究结果也表明，根系统是内生细菌进入植物的入口，因此聚集的内生细菌较多，并通过输导系统由茎部到叶部，可见内生细菌多集中在输导系统。从分离到的内生菌来看，不同香蕉品种、不同的部位，分离到的菌株数量不同，也表明内生菌在不同的植物体内定殖情况不一。这可能是由于植物体内是个微生态环境，寄主植物的改变容易对体内微生物种群动态造成影响；另外，植物本身营养物质的分布，内生菌的侵入途径等对分离结果也有一定的影响。史建荣等［19］报道的关于植物病原真菌致病性分析的研究中阐述了真菌是一类能引起多种植物病害的病原微生物，存在于植株中的真菌大多有不同程度的致病性。本试验结果中，抗病品种和易感品种香蕉内生真菌的分布数量均表现为病株多于健康株。

4 结论

从不同香蕉品种的不同部位共分离得到内生菌438株，其中细菌240株，放线菌142株，真菌56株，故细菌是香蕉内生菌中的优势种群。内生菌数量在各品种中的分布呈现南天黄病株＞巴西蕉健株＞巴西蕉病株＞南天黄健株＞农科一号健株的规律。抗病品种南天黄病株中分离得到的内生菌最多，共计128株，抗病品种南天黄健康株内生菌数量少于病株，而易感品种巴西蕉健康株内生菌数量多于病株。内生菌数量在香蕉各组织中的分布呈现规律为：根部＞球茎部＞假茎部＞叶部。内生真菌在各品种病株中的分布最广泛。筛选出具广谱活性的放线菌10株、细菌2株。其中内生放线菌菌株041的广谱拮抗活性最强，最大抑菌带宽为28.13±1.89 mm。对广谱拮抗内生放线菌菌株041、04-1、19-1、03A-1进行的形态学和16S rDNA序列分析表明，它们属于链霉菌属，具有潜在的开发价值。

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（责任编辑 马鑫）

Endophytes Isolation and Broad-spectrum Antagonistic Bacterias Screening from Banana

Wang Mengying1，2Zhou Dengbo2Jing Tao3Hu Yifeng1，2Gao Zhufen2Xie Qingyi2Zhang Xiyan2Qi Chunlin1
（1. College of Environment and Plant Protection，Hainan University，Haikou 570028；2. Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology，China Academy of Tropical Agricultural Sciences，Haikou 571101；3. Institute of Banana and Plantain，China Academy of Tropical Agricultural Sciences，Haikou 570102）

In order to determine the main distribution of endophytes and their broad-spectrum antimicrobial activity, endophytes were obtained from healthy and diseased tissues of two disease-resistant and one disease susceptible banana cultivars. Endophytes were separated from roots, corms, pseudostems, leaves and store in the ultra-low on Luria-Bertani（LB）, Yeast Extract with supplements（YE）, and Potato Dextrose Agar（PDA）strain store medium. Then screened broad-spectrum antagonistic bacteria which againstFusarium oxysporumf. sp. Cubense,Curvularia lunata,Curvularia fallax,Corynespora cassiicola（Berk & Curt）Wei,Alternaria musae,Deightoniella troulosa,Colletotrichum musae,Pestalogiopsissp.,Btoryosphaeria dothidea. Taxonomy identification of 041, 04-1, 19-1, 03A-1 was conducted by evaluating morphologic characteristics and 16S rDNA gene sequences for phylogenetic analysis. After purification, total of 438 endophytes were obtained. The total of isolates showed that we obtained 240 strains bacteria, followed by 142 strains actinomycetes, and 56 strains fungi. The richest number of endophytes that isolated from diseased NanTian banana cultivars（128）. Ten actinomyces and two bacterias were determined to possess antibiotic activity against Ten banana pathogens. Isolates 041 was the most effective and had 28.13±1.89 mm width of inhibition zone. Isolated 041, 04-1, 19-1, 034-1 were identified asStreptomyces misionensis.

Banana Endophytes Broad-spectrum antagonistic bacteria Isolation

2014-01-03

现代农业产业技术体系建设项目专项（CARS-32）

王梦颖，硕士，研究方向：生态学；E-mail：403151373@qq.com

戚春林，博士，副教授，研究方向：生态学；E-mail：chunlinqu@163.com