重组人gdnf乳腺特异表达载体转染牛胎儿成纤维细胞的研究

虞飞 李斌 张晶晶 丁海麦 张学明

（内蒙古科技大学包头医学院，包头 014040）

重组人gdnf乳腺特异表达载体转染牛胎儿成纤维细胞的研究

虞飞 李斌 张晶晶 丁海麦 张学明

（内蒙古科技大学包头医学院，包头 014040）

为了制备重组人GDNF牛乳腺生物反应器，采用组织块贴壁法分离培养雌性牛胎儿成纤维细胞，连续继代培养75 d，进行形态观察和染色体分析，在此基础上，转染带有新霉素抗性和红色荧光蛋白双重筛选标记的重组人gdnf乳腺特异表达载体pNR-GDNF，G418筛选阳性抗性克隆，进行PCR法鉴定。结果表明，分离培养的牛胎儿成纤维细胞具有正常的形态、分裂增殖特性和染色体数目；目的基因已整合到转基因细胞的染色体上。

牛胎儿成纤维细胞 分离培养 转基因 GDNF

动物乳腺生物反应器是指通过转基因动物乳腺大规模生产供治疗人类疾病和保健用的药用蛋白或其它生物活性物质［1］。转基因动物的乳腺可代替细菌和细胞等生物发酵，对所生产的蛋白质进行翻译后有效地加工和修饰。因而，动物乳腺生物反应器被国际上公认为是转基因动物研究中最具有发展前景的方向之一，也是实现基因工程制药的重要途径。多年来对乳腺生物反应器的研究已积累了许多方法和经验，并在研究中产生了约100种药物的乳腺生物反应器［2］，其中最具有标志性的成果是GTC公司用转基因山羊乳腺生物反应器生产的人抗凝血酶ATryn®于2006年经欧洲医药评价署批准进入治疗应用［3］。

胶质细胞系源性神经营养因子（Glial cell linedireved neurotrophic factor，GDNF）是一种分泌性糖蛋白，属于TGF-β超家族成员［4］。GDNF对多巴胺能神经元具有营养及保护作用，在帕金森病及其它神经损伤疾病的治疗方面显示出了巨大的应用前景［4-9］。基于动物试验的成功研究，GDNF用于帕金森病的治疗已进入二期临床研究［9-13］。然而GDNF在人和动物体中含量很低，从动物体中制备GDNF用于疾病动物模型和临床试验研究是不现实的［14］。因而，应用生物反应器大量生产重组人GDNF用于疾病动物模型和临床试验研究具有潜在的重大社会效益和经济效益。

本研究采用组织块贴壁法分离培养了雌性牛胎儿成纤维细胞，用电击转染法将以neo基因和DsRed2作为双筛选因子的牛β-casein基因5'端调控序列驱动的重组人gdnf乳腺特异表达载体转入体外培养的牛胎儿成纤维细胞，为进一步应用体细胞核移植法制备重组人gdnf牛乳腺生物反应器的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 活体材料 1-3月龄牛胎儿取自本地屠宰场。1.1.2 质粒载体 重组人gdnf乳腺特异表达载体pNR-GDNF（图1），本实验室构建。

1.1.3 主要试剂及耗材 DMEM/F12，G418，胰蛋白酶（Trypsin）购自Sigma公司；Taq DNA 聚合酶，限制性内切酶购自TaKaRa公司；标准胎牛血清为TBD产品；无机盐类为日本和光试剂；无内毒素质粒提取试剂盒、DNA纯化试剂盒购自QIAGEN；培养瓶，培养皿均为Corning公司产品；细胞培养板为Nunc产品；PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 组织块法分离和培养牛胎儿成纤维细胞 采自屠宰场的牛子宫（含胎儿）于37℃灭菌生理盐水中带回实验室，无菌操作挑选雌性胎儿，PBS清洗。参照文献［15］方法，取胎儿耳部组织于DMEM/F12 + 10% FBS中剪成约1 mm3小块，用相同培养液洗3遍，然后将组织块连同培养液一起转移到培养瓶中，轻轻摇动使组织块成均匀分布，吸干组织块周围的培养液，倒置放入培养箱中培养3 h。待组织块贴壁后，缓缓加入适量培养液，继续培养。每天观察并记录细胞的生长情况。待生长的细胞铺满瓶底时，去除组织块，传代扩大培养后，冷冻保存。

1.2.2 牛胎儿成纤维细胞中期染色体数目分析 参照文献［15-17］方法，待细胞生长至汇合度达到70%-80%时，于4℃冰箱中放置15 h后，加入终浓度为0.1 μg/mL秋水仙素，37℃处理3 h；收集脱壁细胞，加入37℃预热的0.075 mol/L KCl 5 mL，于37℃低渗处理30 min后，再加入1 mL 4℃预冷的固定液预固定3 min，低速离心10 min，去上清液；加入固定液6 mL，室温固定30 min，低速离心10 min，小心吸出大部分上清液，留少量固定液重悬细胞进行滴片；室温自然干燥后，吉姆萨染色30 min，显微镜下观察拍照，分析核型。

1.2.3 牛胎儿成纤维细胞对G418耐受性的检测 将培养至第3代的细胞以5×104个细胞/孔的密度接种于两个12孔板中，当细胞生长至80%汇合度时，更换培养液，同时在12孔板中分别加入G418至终浓度为0、100、200、300、400、500、600、700和800 μg/mL，每种浓度接种2孔细胞，每2 d换液1次，每天观察细胞生长情况，记录培养在不同G418浓度中的细胞全部被杀死的时间。试验重复2次。以7-10 d内杀死全部细胞的G418的浓度作为筛选时的最适合浓度。

1.2.4 电穿孔法转染牛胎儿成纤维细胞 取对数生长期的细胞，调整密度为1×107/mL；取400 μL细胞悬液加入到间距4 mm电击杯中，加入12 μg线性化的质粒pNRTCNbG使其终浓度为30 μg/mL，轻轻敲击杯底使DNA和细胞混匀，550 V电压、50 μF电容条件下电击转染，电击完成后，电击槽中静置1 min，冰浴2 min，然后将细胞以1×106密度接种于100 mm培养皿中，于37℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养。

1.2.5 稳定转染细胞的筛选 转染的细胞培养48 h后，收集细胞，重新以3×105个细胞密度接种于100 mm培养皿中，加入G418至终浓度500 μg/mL，继续培养，每2 d换液1次，8-10 d后，在荧光显微镜下标出红荧光细胞克隆；用克隆杯法分离红荧光克隆细胞，接种于6孔板中扩大培养，待细胞生长至基本汇合时，冷冻保存。

1.2.6 转基因细胞的鉴定 提取稳定转染细胞基因组DNA，PCR检测gdnfcDNA是否整合到细胞基因组DNA中。PCR上游引物：5'-GACCTCGAGATGAA GTTATGGGATGTCGTGGCTGTC-3'，下游引物：5'-GA GCTCGAGTCAGATACATCCACACCTTTTAG-3'；反应条件为：94℃变性45 s，58℃复性45 s，72℃延伸1 min，共35个循环。

1.2.7 数据分析 使用SPSS11.0软件对数据进行x2检验分析，P＜0.05为显著差异。

2 结果

2.1 组织块分离培养牛胎儿成纤维细胞的形态学观察

组织块贴壁培养3-4 h，加入培养液后仅有极少数组织块漂浮，大部分组织块已贴壁；培养1 d后，部分组织块边缘开始游离出少许成纤维细胞（图2-A）；培养2 d后，多数组织块周围已有均匀的成纤维细胞迁出（图2-B）；培养4 d后，组织块周围的成纤维细胞生长旺盛，数量明显增多，向四周扩散（图2-C）；培养6 d后，组织块周围的细胞已生长至完全汇合，且铺满了瓶底（图2-D）；去除组织块，胰蛋白酶消化，转至T75培养瓶中继续培养，待细胞生长至80%汇合时，冷冻保存，留少量细胞继续传代培养；随着传代次数的增多，绝大部分细胞呈纤维状，高度汇合的细胞呈旋涡状生长（图2-E）；说明在细胞生长过程中，成纤维细胞呈优势生长且在细胞群中占主导地位；传代培养75 d后，细胞呈衰老状态，生长变得极缓慢，细胞体积增大，扁平化，有空泡出现等现象（图2-F）。

2.2 牛胎儿成纤维细胞的染色体数目分析

取传代培养15 d和60 d的牛胎儿成纤维细胞进行分裂中期相染色体制片，其中选择分散良好、轮廓清晰的分裂相进行染色体形态观察和数目统计。结果（图3）表明，绝大多数细胞染色体为2n=60，58条常染色体为端部着丝粒，2条性染色体为中部着丝粒。染色体倍型分析结果表明，培养15 d的牛胎儿成纤维细胞染色体成二倍性的比例为83.3%，培养60 d的细胞二倍体比例为77.8%，经x2检验，二者之间无显著差异（表1）。染色体组型分析表明体外长期培养的牛胎儿成纤维细胞能够进行正常的染色体复制和分裂。

2.3 牛胎儿成纤维细胞对G418的耐受性检测

利用不同浓度的G418筛选，结果发现，G418的浓度在200-900 μg/mL的范围时，对牛胎儿成纤维细胞有明显的毒害作用，细胞全部被杀死的培养时间随G418浓度的增大而缩短。G418浓度为500 μg/mL时，细胞培养7 d被全部杀死；G418浓度为600 μg/mL时，细胞培养6 d被全部杀死（图4）。因此后续转染试验中使用的G418浓度为500 μg/mL。

2.4 稳定转染细胞的筛选及PCR鉴定

电击转染的牛胎儿成纤维细胞，用G418筛选7 d后，用克隆杯分离形态正常、生长旺盛的红荧光抗性克隆，接种到6孔板中生长至基本汇合度时（图5），胰蛋白酶消化，冷冻保存。取少量扩培细胞，提取基因组DNA，PCR法检测，得到了576 bp预期条带（图6）表明，目的基因已整合到转基因细胞的染色体上。

3 讨论

自1997年体细胞克隆羊多莉［18］诞生以来，对体细胞进行遗传修饰后作为核移植供体细胞制备转基因动物已成为乳腺生物反应器研制的一种理想策略。用于体细胞核移植的供体细胞种类非常广泛，包括来自胎儿或成体的成纤维细胞、乳腺上皮细胞、颗粒细胞、肌肉细胞、输卵管上皮细胞、睾丸生殖细胞、支持细胞、肝细胞、神经细胞等［19］。由此可见，多种分化的体细胞甚至是分化终端的体细胞，其细胞核在卵母细胞质的作用下经重编程后仍具有全能性。但由于受到转基因技术的要求，外源基因稳定转染后用于核移植的供体细胞的种类却很少。对于转基因体细胞克隆动物的制备，从细胞的转染到阳性克隆的获得再到扩大培养至少需要30-40 d，再加上原代细胞培养及细胞纯化，到转基因细胞核移植时，细胞在体外培养至少需要50-60 d，远比大多数体细胞核移植所用的供体细胞在体外培养的时间长［15］。胎儿成纤维细胞具有易分离、易培养、传代次数较多、体外培养时间长、核型较稳定等优点，可以满足筛选时体外培养时间长的要求，是目前最理想的可用于遗传修饰的供体细胞。已成功的转基因克隆绵羊［20，21］、山羊［22］、猪［23］、牛［24，25］都是使用基因打靶胎儿成纤维细胞作为核供体细胞而制备的。本研究分离培养的牛胎儿成纤维细胞呈典型的纤维状，生命力旺盛，可连续传代培养达75 d，对连续培养60 d的细胞进行初步的核型分析表明细胞仍具有稳定的遗传特性，可以满足体外遗传修饰的要求。

研究者［26，27］认为，用混合的转基因细胞克隆进行随机整合转基因克隆动物的制备可以避免将研究集中于少数几个发育潜能未知的单细胞克隆而导致灾难性后果，而且短期抗性筛选得到的混合转基因克隆细胞比转染后长期药物筛选得到的单克隆细胞更适合于核移植；同时，这种策略可以增加后代中基因插入位点的可能性，从而有可能筛选出高表达的转基因系。本研究使用重组人gdnf乳腺特异表达载体以neo基因和DsRed2作为双筛选因子，电击转染的牛胎儿成纤维细胞，用G418筛选7 d后，用克隆杯分离形态正常、生长旺盛的红荧光抗性克隆，接种到6孔板中生长至基本汇合度时，冷冻保存，避免了长时间抗性筛选对核供体细胞带来的不利影响；同时使用DsRed2作为筛选因子，选用表达红荧光蛋白的细胞作为核供体可排除非转基因细胞用于核移植的风险。

4 结论

本研究采用组织块贴壁法分离培养了雌性牛胎儿成纤维细胞，用重组人gdnf乳腺特异表达载体pNR-GDNF转染细胞，经抗性筛选及PCR鉴定，获得了稳定转染重组人gdnf的转基因细胞，为进一步应用体细胞核移植法制备重组人GDNF 牛乳腺生物反应器的研究奠定了基础。

［1］Clark AJ. The mammary gland as a bioreactor：expression, processing, and production of recombinant proteins［J］. J Mammary Gland Biol Neoplasia, 1998, 3（3）, 337-350.

［2］Houdebine LM. Use of transgenic animals to improve human health and animal production［J］. Reprod Dom Anim, 2005, 40：269-281.

［3］Bösze Z, Baranyi M, Whitelaw CB. Producing recombinant human milk proteins in the milk of livestock species［J］. Adv Exp Med Biol, 2008, 606：357-393.

［4］Kitagawa H, Hayashi T, Mitsumoto Y, et al. Reduction of ischemic brain injury by topical application of glial cell line-derived neurotrophic factor after permanent middle cerebral artery occlusion in rats［J］. Stroke, 1998, 29（7）：1417-1422.

［5］Li L, Wu W, Lin LF, et al. Rescue of adult mouse motoneurons from injury-induced cell death by glial cell line-derived neurotrophic factor［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 1995, 92：9771-9775.

［6］Kim BT, Rao VL, Sailor KA, et al. Protective effects of glial cell linederived neurotrophic factor on hippocampal neurons after traumatic brain injury in rats［J］. J Neurosurg, 2001, 95：674-679.

［7］Tomac A, Lindqvist E, Lin LF, et al. Protection and repair of the nigrostriatal dopaminergic system by GDNF in vivo［J］Nature, 1995, 373：335-339.

［8］Gash DM, Zhang Z, Ovadia A, et al. Functional recovery in parkinsonian monkeys treated with GDNF［J］. Nature, 1996, 380：252-255.

［9］Gill SS, Patel NK, Hotton GR, et al. Direct brain infusion of glial cell line-derived neurotrophic factor in Parkinson disease［J］. Nat Med, 2003, 9：589-595.

［10］Love S, Plaha P, Patel NK, et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor induces neuronal sprouting in human brain［J］. Nat Med, 2005, 11：703-704.

［11］Patel NK, Bunnage M, Plaha P, et al. Intraputamenal infusion of glial cell line-derived neurotrophic factor in PD：a two-year outcome study［J］. Ann Neurol, 2005, 57：298-302.

［12］Slevin JT, Gerhardt GA, Smith CD, et al. Improvement of bilateral motor functions in patients with Parkinson disease through the unilateral intraputaminal infusion of glial cell line-derived neurotrophic factor［J］. J Neurosurg, 2005, 102：216-222.

［13］Patel NK, Pavese N, Javed S, et al. Benefits of putaminal GDNF infusion in Parkinson disease are maintained after GDNF cessation［J］. Neurology, 2013, 81：1176-1178.

［14］张学明, 罗奋华, 苏惠敏, 等. 人gdnf基因的克隆及其在牛β-酪蛋白基因座定位整合载体的构建［J］. 生物技术通报, 2009（5）：113-118.

［15］尹明, 章轶哲, 多曙光. 胎牛成纤维细胞的分离培养［J］. 实验动物科学, 2010, 27（3）：1-6.

［16］梁伟, 肖红, 高笑宇, 等. 小鼠KGF基因毛囊特异性表达载体的构建及mESC脂质体悬浮转染条件的优化［J］. 生物技术通报, 2011（11）：107-117.

［17］Yan XR, Yang YH, Liu W, et al. Differentiation of neuron-like cells from mouse parthenogenetic embryonic stem cells［J］. Neural Regeneration Research, 2013（4）：293-300.

［18］Wilmut I, Schnieke AE, McWhir J, et al. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells［J］. Nature, 1997, 385（6619）：810-813.

［19］Denning C and Priddle H. New frontiers in gene targeting and cloning：success, application and challenges in domestic animals and human embryonic stem cells［J］. Reproduction, 2003, 126：1-11.

［20］Schnieke AE, Kind AJ, Ritchie WA, et al. Human factor IX transgenic sheep produced by transfer of nuclei from transfected fetal fibroblasts［J］. Science, 1997, 278（5346）：21.

［21］McCreath KJ, Howcroft J, Campbell KHS, et al. Production of gene targeting sheep by nuclear transfer from cultured somatic cells［J］. Nature, 2000, 405：1066-1069.

［22］Baguisi A, Behboodi E, Melican DT, et al. Production of goats by somatic cell nuclear transfer［J］. Nat Biotechnol, 1999, 17（5）：456-461.

［23］Lai L, Kolber-Simonds D, Park KW, et al. Production of a-1, 3-galactosyl transferase knockout pigs by nuclear transfer cloning［J］. Science, 2002, 295：1089-1092.

［24］Wells DN, Misica PM, McMillan WH, et al. Production of cloned bovine fetuses following nuclear transfer using cells from a fetal fibroblast cell line［J］. Theriogenology, 1998, 49：330.

［25］Kuroiwa Y, Kasinathan P, Matsushita H, et al. Sequential targeting of the genes encoding immunoglobulinm and prion protein in cattle［J］. Nat Genet, 2004, 36：775-780.

［26］Chen SH, Vaught TD, Monahan JA, et al. Efficient production of transgenic cloned calves using preimplantation screening［J］. Biol Reprod, 2002, 67：1488-1492.

［27］杨东山, 杜晨光, 高飞, 等. 牛胎儿成纤维细胞的组织块贴附法分离培养与电穿孔法基因转染［J］. 动物学研究, 2006, 27（1）：41-47.

（责任编辑 李楠）

Transfection of Bovine Fetal Fibroblast with the Vector for Expressing Human GDNF Specifically in Mammary Gland

Yu Fei Li Bin Zhang Jingjing Ding Haimai Zhang Xueming
（Baotou Medical College，Inner Mongolia University of Science and Technology，Baotou 014040）

In order to prepare bovine mammary gland bioreactor for production of human recombinant GDNF, the female bovine fetal fibroblast cells were successfully isolated using tissue bulk attachment. The fibroblast cells were cultured consecutively for 75 days for further morphologic observation and chromosome analyzing. The plasmid vector pNR-GDNF, which contained the Neorgene and the DsRed2 gene as positive selection marker genes and human GDNF cDNA gene regulated by bovine beta-casein promoter for specific expression in mammary gland, was transfected into the bovine fetal fibroblast cells by electroporation. After selection with G418 for 7 days, resistant cells expressing red fluorescence protein were isolated, cultured, expanded and cryopreserved by standard procedures. The transgenic cells were indentified by PCR. The results showed that bovine fetal fibroblast cells possessed normal morphology, multiplication characteristics and chromosome number and the foreign gene was integrated into the genome.

Bovine fetal fibroblast Isolation and culture Gene transfer GDNF

2014-01-18

国家自然科学基金资助项目（31060304），内蒙古高等学校科学研究项目（NJ10184）

虞飞，男，硕士研究生，研究方向：基因工程；E-mail：1012058164@qq.com

张学明，男，副教授，研究方向：重组药物蛋白；E-mail：byzhxm@126.com