牦牛不同组织TLR3、TLR5mRNA转录水平相对定量研究

陈亚冰兰道亮林宝山黄偲黄勇李键，

（1.西南民族大学生命科学与技术学院，成都 610041；2.西南民族大学青藏高原研究院，成都 610041）

牦牛不同组织TLR3、TLR5mRNA转录水平相对定量研究

陈亚冰1兰道亮2林宝山1黄偲1黄勇1李键1，2

（1.西南民族大学生命科学与技术学院，成都 610041；2.西南民族大学青藏高原研究院，成都 610041）

参考牦牛TLRs基因序列设计荧光定量PCR特异性引物，建立检测牦牛TLRs相对表达量的荧光定量PCR方法，分析TLR3及TLR5基因在牦牛不同器官组织中的转录水平。结果显示两基因具有不同的表达谱及表达量，其中TLR3基因除在乳腺组织外，在其它组织器官中均有转录，其中在心、大肠、胃和肌肉组织中表达量较高；TLR5基因则在心、肺、大肠、小肠、胃、肌肉、卵巢组织中具有较高的表达量。该试验结果表明，TLRs在不同组织器官转录水平差异较大，可能与其对病原体的识别有关；同一个基因在不同组织中存在差异性，这可能与基因作用机理相关。

牦牛 转录水平 TLRs 相对定量

病原微生物感染宿主后，宿主细胞通过体内广泛表达的病原分子模式识别受体（Pattern recognition receptors，PRRs）检测病原相关分子模式（Pathogenassociated molecular patterns，PAMPs）的存在，激活宿主的天然免疫应答［1］。Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）是一种重要的模式识别受体，通过识别病原体相关分子模式，刺激信号级联反应，最终启动了机体的天然免疫和引起获得性免疫反应［2-4］。不同TLRs可以识别相应的PAMPs：TLR3识别病毒双链RNA（Double strand RNA，dsRNA）、单链RNA病毒的复制中间产物dsRNA以及聚肌甘酸［poly（I：C）］［5，6］，TLR5主要识别微生物鞭毛蛋白［3］，两种受体在识别微生物感染感染中起着关键作用。近年来，实时荧光定量PCR技术已经被用于检测TLRs在不同物种、不同组织、不同细胞中的表达量［7-10］。然而，采用定量方法研究牦牛体内TLRs表达分布还没有相关报道［11-14］。

牦牛是世代生活在高原环境下的特殊物种，其机体早已适应了高原的低氧、严寒等恶劣天气，对牦牛的抗病分子机制进行研究，一方面可以深入理解高原动物特有的免疫机制；另一方面也为牦牛的抗病育种奠定理论基础。本试验前期克隆了牦牛TLR3及TLR5基因序列，基因序列分析结果表明牦牛TLRs基因和其它物种相应基因具有较高的同源性，因此，下一步要重点比较分析TLRs基因在牦牛体内表达模式。本研究基于SYBR Green I RT-CR技术，检测并分析TLR3、TLR5基因在不同组织中的表达水平，为后续研究牦牛体内的相关免疫机制奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物 5头牦牛（母，平均年龄4岁）来自甘南藏族自治州夏河县安，均属于麦洼牦牛。采集11种组织样本（心、肝、脾、肺、肾、大肠、小肠、肌肉、胃、卵巢和乳腺）均放入液氮中送回实验室保存。

1.1.2 主要仪器与试剂 荧光定量PCR仪及普通PCR仪均是Bio-Rad公司产品；Trizol购自Invitrogen公司；RT反转录酶及SYBR Premix Ex TaqTMII试剂盒购自TaKaRa公司，质粒提取及DNA胶回收试剂盒购于Axygen公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 根据实验室前期获得的牦牛TLR3及TLR5全长序列，依据定量引物设计原则，设计定量引物，普通PCR检验引物特异性，引物序列与预期扩增片段长度如表1，引物由上海Invitrogen公司合成。

1.2.2 组织RNA提取 称量约200 mg组织样品后迅速转移至液氮预冷的研钵中，研杵研磨组织，直至研磨成粉末状。加入1 mL的Trizol，室温静置直至样品完全融化，吸取1 mL至无RNA酶的离心管中，加入200 μL的氯仿，剧烈振荡，室温静置5 min，12 000 r/min离心15 min；小心吸取上清液，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温静置10 min；12 000 r/min离心10 min；弃上清，沉淀加入1 mL 75%的乙醇洗涤，12 000 r/min离心5 min；弃上清，室温干燥沉淀，加入30 μL DEPC水溶解RNA，检测RNA的纯度及完整性。

1.2.3 cDNA的反转录合成 RNA需要进行去除基因组的处理：5×gDNA Eraser Buffer 2.0 μL，gDNA 1 μL，RNA 2 μg，Rnase Free dH2O补 足 到10 μL，42℃ 2 min 进行DNA去除试验并得到反应液1。采用20 μL体系进行反转录反应：反应液1 10 μL，PrimeScript RT Enzyme MixI 1.0 μL，Primer Mix 1.0 μL，5× PrimeScript Buffer2 4.0 μL，RNase Free dH2O 4.0 μL。按以下程序进行反转录反应：37℃、15 min；85℃、5 s，生成的cDNA保存于-20℃备用。

1.2.4TLR3、TLR5基因荧光定量PCR检测方法及组织表达谱建立

1.2.4.1 引物特异性鉴定 选取牦牛脾脏组织cDNA为模板首先进行普通PCR反应来检验引物的特异性，选择特异性较好的引物进行荧光定量PCR反应，根据溶解曲线的单一性选择最近定量引物。

1.2.4.2 荧光定量PCR反应条件优化 荧光定量PCR的循环条件进行了两步法和三步法的摸索；退火温度从55℃依次递增至65℃，每次递增1℃，确定最佳退货温度；最终确定采用三步法进行定量反应，TLR3最佳退火温度是58℃，TLR5及β-actin最佳退火温度是60℃。Real-time PCR反应体系为15 μL：SYBR Premix Ex TaqTMII 7.5 μL，上下游引物各0.5 μL，模板1 μL，dH2O 5.5 μL。PCR扩增程序如下：95℃预变性30 s；95℃变性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸20 s，39个循环，添加熔解曲线；每个组织样品添加3个重复，试验同时添加一个以dH2O为模板的阴性对照。

1.2.4.3TLR3、TLR5及β-actin基因标准曲线建立 提取阳性菌液质粒，将获得的质粒进行浓度测定，用EASY dilution进行10倍倍比稀释，置于-20℃保存备用。以连续10倍倍比稀释（1×101-1010copies/μL）的阳性质粒标准品为模板进行定量PCR反应，并制作各基因的标准曲线。

1.2.4.4 定量PCR检测TLR3、TLR5基因在各组织中的表达分布 分别以5头母牦牛11种组织cDNA为模板，进行定量PCR反应检测目的基因的表达量，采用Pfaffl method计算出基因在各组织的相对表达量，同时应用SPSS 18.0软件计算重复样品之间Ct均值以及标准偏差，最后使用excel制图功能绘制出基因在牦牛各组织中的相对表达柱状图。

Etarget：目的基因扩增效率；Ereference：内参基因扩增效率；control：对照组；experiment：试验组。

2 结果

2.1 RNA完整性检测

提取的总RNA用1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示，可明显地看到28S、18S及5.5S rRNA 3条带，说明提取的 RNA无降解，可用于反转录及后续定量试验。

2.2 引物特异性检验

以牦牛脾脏组织cDNA为模板、TLR3-S、TLR3-A、TLR5-S、TLR5-A、Actin-S、Actin-A为引物进行荧光定量PCR反应。基因的熔解曲线见图2，从图2可以看出，Actin基因在Tm=（82±0.5）℃、TLR3在溶解温度为Tm=（83.5±0.5）℃，TLR5在溶解温度Tm=（85±0.5）℃时出现单一的特异性峰，表明该引物特异性良好。菌液测序结果正确，证明扩增片段是目的片段。

2.3 基因标准曲线建立

对两基因阳性标准品做10倍梯度稀释（1×101-1010copies/μL），作为标准曲线制备的模板，按照各基因不同稀释度的Ct值，选择最佳检测范围，制作标准曲线（图3）。从图3可以看出，质粒浓度为1×102-108copies/μL时，TLR3基因扩增效率达到了95%，相关系数为0.999；质粒浓度为1×101-108copies/μL时，TLR5基因扩增效率达到了94.3%，相关系数为0.999；质粒浓度范围为1×102-108copies/μL时，β-actin基因扩增效率达到了95.4%，相关系数为0.999。

2.4 荧光定量PCR检测TLR3、TLR5基因在牦牛组

织中的表达分布

以β-actin基因作为内参基因，采用Pfaffl method，以小肠基因表达量作为对照组，分析TLR3、TLR5基因在牦牛不同组织中的表达量水平。其中TLR3在心脏，大肠，胃，肌肉及卵巢等组织表达量较高（图4）；TLR5在心，肺，大肠，小肠，胃，肌肉，卵巢，肌肉，乳腺等组织表达量较高（图5）。

3 讨论

目前，常用的定量PCR检测方法有Taqman荧光探针方法和SYBR Green I染料方法，其中SYBR Green I荧光嵌合染料因具有无需设计、标记荧光探针和操作简便、成本低等优点，深受研究者们青睐［15］。本试验中，扩增产物熔解曲线分析发现扩增产物呈现特异性较好的单峰，测序结果证实为相应的目的片段，表明引物特异性良好。本试验采用相对定量法，利用β-actin来校准目的基因的表达量，β-actin和目的基因定量具有相似的扩增效率，均在95%左右，符合后续试验要求。

TLRs作为一种重要的模式识别受体，不仅在天然免疫中起重要作用，同时也是天然免疫和获得性免疫的连接点，其可以介导获得性免疫应答［16］。TLRs的研究为阐明天然免疫机制及寻找由于免疫失调所致疾病的治疗提供新的思路［17］。牦牛是青藏高原上的一个特有物种，其机体可能存在特殊的抗病免疫机制，因此对其免疫机制研究就具有一定的必要性。本实验室前期工作发现牦牛TLR3、TLR5基因与其它平原哺乳动物相应基因具有较高的同源性。因此，分析比较它们的组织表达模式差异可以为理解牦牛机体免疫机制提供了新的思路。TLR3是识别dsRNA的特异性受体，当病毒感染机体时，会在机体的细胞内复制产生dsRNA，TLR3可以识别dsRNA，并将信号向下游传递，启动和调节机体的天然免疫反应，并继而激发获得性免疫反应［5，6］。本试验发现TLR3表达具有一定的组织特异性，其中在心脏、大肠、胃、肌肉及卵巢等组织表达量较高，这可能与局部组织对病原体的识别和抵抗能力有关。TLR5基因通过识别、结合入侵病原菌的鞭毛蛋白，激活特定的信号转导通路，诱发合成细胞因子，启动机体的天然免疫反应，并诱发获得性免疫反应［4］。本试验利用实时荧光定量PCR技术对牦牛器官及组织进行TLRs mRNA转录水平进行研究，为进一步TLRs免疫机制奠定了理论基础。当然，仅检测TLRs mRNA转录水平不能完全代表Toll样受体蛋白的表达水平，TLRs在不同组织中的转录水平差异是否影响到蛋白质的表达水平，从而影响下游与配体的结合能力、下游信号转导及细胞因子的释放，有待下一步的研究。下一步同时将重点针对不同品种、不同海拔以及不同年龄段牦牛体内组织器官转录水平进行比较。

4 结论

本研究发现TLR5具有一个分布广泛组织表达谱，同时在心、肺、大肠、小肠、胃、肌肉、卵巢及乳腺等组织表达量较高，这可能与病原体侵入机体途径多样化相关。

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（责任编辑 李楠）

Relative Quantification of mRNA Transcription of TLR3 and TLR5 in Different Tissues of Yak

Chen Yabing1Lan Daoliang2Lin Baoshan1Huang Cai1Huang Yong1Li Jian1，2
（1. College of Life Science and Technology，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041；2. College of Tibetan Plateau Research，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041）

According to the sequences of yak TLR3 and TLR5, the real-time PCR primers were designed to establish a method for the detection of mRNA transcription of TLRs by Real-time quantitative PCR, and the transcription level of TLRs in different tissues of yak was analyzed. The results showed that two genes have different expression pattern and expression level in tissues. The TLR3 mRNA was detected in examined tissues except mammary gland, and it was expressed at a higher level in heart, large intestine, stomach and muscle. The TLR5 mRNA level was higher in heart, lung, large intestine, small intestine, stomach, muscle and ovary. The results indicated that there exists difference in the transcription level of TLRs in tissues, which may be associated with the recognition of pathogens. For the same gene, the mechanism of gene may bring difference in expression level in different tissues.

Yak Transcriptional level TLRs Relative quantification

2014-03-15

中央高校青年教师基金项目（2014NZYQN37）

陈亚冰，男，硕士研究生，研究方向：高原动物免疫分子机制；E-mail：cybxc923410296@126.com

李键，男，博士，教授，研究方向：动物生殖调控；E-mail：lijian@swun.cn；兰道亮，男，博士，副教授，研究方向：动物免疫机理；E-mail：landaoliang@163.com