橡胶树转基因植株Southern杂交体系的优化

李季鲁旭，2黄天带华玉伟黄华孙

（1. 中国热带农业科学院橡胶研究所 农业部橡胶树生物学重点开放实验室，儋州 571737；2. 海南大学农学院，海口 570228）

橡胶树转基因植株Southern杂交体系的优化

李季1鲁旭1，2黄天带1华玉伟1黄华孙1

（1. 中国热带农业科学院橡胶研究所 农业部橡胶树生物学重点开放实验室，儋州 571737；2. 海南大学农学院，海口 570228）

以地高辛标记的Southern杂交技术已广泛应用于多个物种中。选择橡胶树为材料，就基因组DNA的提取、探针标记方法的选择以及具体的杂交操作过程等方面对该体系进行了优化。结果表明，至少40 μg高质量的DNA在300 μL的大酶切体系中，酶切12 h可获得良好效果；PCR法标记的探针杂交条带清晰、背景浅，其效率明显强于随机引物法标记的探针。本研究优化的体系信号强、背景浅和灵敏度高，为橡胶树Southern杂交鉴定分析提供参考。

橡胶树 转基因 Southern blot 地高辛 PCR法标记

Southern印迹杂交技术因其高灵敏度、高特异性已成为检测关键性DNA片段的经典方法之一［1］，目前广泛应用于分子生物学和基因工程等研究领域。Southern杂交探针分为放射性和非放射性两类［2］，早期以同位素标记的放射性探针为主，具有较高的灵敏度和特异性，但存在半衰期，易造成放射性污染。非放射性地高辛（DIG）标记探针具有敏感性高、方便、安全和探针储存期长等优点，得到了广泛的应用［3-5］。探针标记的方法主要有随机引物延伸标记法、缺口平移法、末端标记法、PCR法和荧光标记法等。但其中最为常用是PCR标记法和随机引物法［6］。目前棉花［7］、烟草［8］、水稻［9］、油菜［10］、小麦［11］等植物利用地高辛标记的Southern杂交均获得较好的杂交效果，而橡胶树基因组结构较为复杂［12］，同位素探针标记的Southern杂交技术虽已成功应用［13-16］，但地高辛标记的Southern杂交还较为困难，主要表现在条带模糊，背景较深，试验结果读取不够准确等［17-20］。本研究主要以转基因橡胶树PCR检测阳性的植株为材料，结合大量的试验经验，从基因组DNA的提取，探针标记的方法以及杂交过程中的细节对橡胶树地高辛标记的Southern杂交方法进行优化，旨在为转基因橡胶树Southern杂交鉴定奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

转启动子陷阱载体的转基因植株1株［21］，命名为启T13，转HbFCA启动子的转基因植株3株［22］，分别命名为S启j10、S启j12和S启j13，上述4株转基因植株骨架载体均为pCAMBIA2301；转pCAMBIA2301空载体的转基因植株2株，命名为PT55和PTj71，均由本课题组利用次生体胚发生方法获得，以上植株均由GUS和PCR检测为阳性，对照植株为非转基因植株。

1.2 方法

1.2.1 目的基因Npt扩增及序列分析 以pCAMBIA-2301载体质粒为模板，利用引物Npt-f/r PCR扩增453 bp的目的基因Npt片段［23］，PCR反应体系及程序参照PrimeSTAR®Max DNA聚合酶（TaKaRa Cat. #DR045A）说明书。1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，并切胶回收，取部分回收产物加尾，溶液回收后连接至pMD®19-T载体（TaKaRa Cat. #D102A）上，挑取3个单克隆交由北京华大基因有限公司测序。

1.2.2 地高辛探针标记 分别采用随机引物法和PCR法对目的基因Npt进行标记。随机引物法和PCR法探针标记的具体过程分别参考地高辛标记试剂盒II（Roche Cat. #REF 11 585 614 910）及PCR法DIG探针合成试剂盒（Roche Cat. #REF 11 636 090 910）说明书，其中随机引物法和PCR法的模板均为测序正确的Npt回收产物，浓度分别是1 μg和50 ng。取2 μL PCR标记产物1%琼脂糖检测探针标记效率及产量。

1.2.3 探针标记效率的检测 将上述两种方法标记的探针以及地高辛标记试剂盒II中的阳性对照DNA稀释100倍后作为起始浓度按照试剂盒说明书进行系列梯度稀释，各取1 μL点在带正电的尼龙膜上，紫外交联（1200J），按照说明书的方法进行标记效率的检测，并比较对照与DIG标记DNA稀释样品的显色强度，根据稀释倍数换算出探针浓度。

1.2.4 橡胶树叶片基因组DNA的提取 DNA提取的过程详见DNA提取试剂盒（TIANGEN Cat. #DP320）说明书，尽量选用的材料是转基因橡胶树淡绿期叶片，每个样品抽提10管DNA，用100 μL的灭菌蒸馏水加入到第一管DNA的吸附柱内洗脱，将洗脱液重新加回到原来的吸附柱内再次洗脱，而后用这100 μL的洗脱液重复上述步骤洗脱第2管，直至利用这100 μL洗脱完这10管DNA。取1 μL电泳检测提取DNA的质量，确保无明显的蛋白质和RNA残留后，分光光度计测浓度。

1.2.5 样品酶切及电泳 每个样品取40-60 μg进行酶切，酶切体系为300 μL，其中包含30 μL 10×NEB Buffer 2，8-10 μL的限制性内切酶Hind III（NEB）。37℃酶切12-16 h。酶切结束后，取5 μL检测酶切是否彻底，之后无水乙醇沉淀DNA，加入loading buffer后上样，待溴酚蓝跑至凝胶底端后停止电泳。

1.2.6 真空转膜及固定 琼脂糖凝胶的变性与中和参考地高辛标记试剂盒II说明书。使用真空转移仪进行转膜，将转好的尼龙膜放在2×SSC浸泡2 min左右，浸洗2次后将膜洗至中性，并去除膜上的凝胶碎片和杂质，紫外交联（1200J）固定。

1.2.7 杂交及显影 杂交及显影过程参照说明书，略有改动。杂交液42℃预热，将膜放置在杂交管中，预杂交2 h。取适量探针加入到100 μL杂交液中，PCR仪99℃变性10 min后立即放置冰上，将42℃预热的杂交液10 mL倒入杂交管中，加入变性好的探针，轻轻混匀，50℃（按照试剂盒说明书的方法计算Mpt基因杂交温度为48℃-53℃，取中间温度50℃作为Npt基因的杂交温度）中速转动杂交16 h。膜洗涤时，0.5×SSC，0.1% SDS（预热到68℃）中68℃振荡洗膜2×20 min。封闭溶液工作液和抗体溶液工作液孵育时间延长至40 min，其余过程与说明书相同。依次进行显影（一般1 min左右）、水漂洗（10 s）、定影（30 s），定影结束后，用流动的清水冲洗胶片两面，晾干，照相留存。

1.2.8 探针洗脱及再次杂交 探针的洗脱及再次杂交参照说明书在杂交炉中进行。本研究中先用随机引物标记的探针进行第一次杂交，剥离后，用PCR标记的探针进行再次杂交。

2 结果

2.1 地高辛标记探针的检测

2.1.1 常规PCR检测 PCR标记探针电泳检测结果如图1所示，未标记的Npt基因片段大小为453 bp，而PCR法标记上地高辛后，由于DIG的分子量较大，高效率掺入DNA后，探针的分子量明显增大，电泳检测时导致迁移速率比没有掺杂DIG的对照慢，分子量大小在700 bp左右，表明探针标记成功。

2.1.2 地高辛标记探针效率的检测 检测结果如图2所示，对照DNA出现4个稀释的探针点，而随机引物法和PCR标记法6个稀释的探针点均能较好地显现。经亮度比对并根据稀释浓度换算发现，随机引物法标记的探针浓度为3 pg/μL×10×100×100= 300 ng/μL，PCR标记的探针浓度是3 pg/μL×10× 3.3×100×100=990 ng/μL，根据地高辛杂交试剂盒要求探针浓度为25 ng/mL，因此随机引物法标记的探针加入量为0.85 μL/10 mL，而PCR标记法标记的探针加入量为0.30 μL/10 mL。

2.2 橡胶树基因组DNA的质量检测

Southern杂交要求提取具有较高质量的DNA，本研究利用试剂盒提取橡胶树DNA，电泳结果如图3所示，DNA条带主带明显，并无拖尾现象，点样孔处无明显残留。紫外分光光度计检测样品的OD值，待测样品的OD260/OD280均在1.8-1.9之间，说明样品中蛋白含量、RNA含量均较少，而OD260/OD230均大于2.0，说明样品中无机盐小分子杂质较少。本研究中利用DNA提取试剂盒提取的DNA纯度高，适用于Southern杂交所需DNA的要求（表1）。

2.3 橡胶树Southern杂交酶切及转膜

本研究曾用10 μg/80 μL和30 μg/300 μL左右的DNA进行酶切，但是Southern杂交效果不理想，带型很弱，甚至无法分辨拷贝数（结果未列出）。本试验中利用至少40 μg的DNA量，在300 μL的酶切体系中Hind III酶切过夜，取5 μL酶切过夜后的产物检测如图4-A，结果显示酶切产物高分子质量区较亮，低分子质量区较暗，酶切效果较好。将剩余的酶切产物回收后点样，低电压跑过夜，完全符合Southern杂交的酶切要求，2-3样品亮度有些偏暗，考虑可能是DNA模板较少，为40 μg，酶切效果较好，而5-8样品模板为60 μg，亮度均一一致，与未酶切DNA相比可见酶切彻底，酶切效果好（图4-B）。利用真空转移仪将DNA转移至尼龙膜上，并将转移后的胶放在成像系统中，观察DNA的转移情况，一般1-1.5 h可以将胶上的DNA完全转移至尼龙膜上。

2.4 Southern杂交检测结果

将尼龙膜固定后进行地高辛杂交，两种探针标记方法的杂交结果中对照DNA酶切与未酶切的样品均无杂交带，随机引物法的杂交背景较深，杂交条带不清晰，探针中的杂质影响最终的结果，表现为黑色背景，杂交效率较低，部分单株的拷贝数无法识别（图5-A）；而PCR标记法的杂交背景较浅，杂交条带清晰，易分辨，整个结果（图5-B）中无明显的黑色背景，符合预期结果。

3 讨论

3.1 不同方法探针标记比较

用于Southern杂交探针标记的方法有很多种，常用的有随机引物延伸法、PCR标记法和切刻平移法。随机引物法标记探针需要大量的DNA，制备耗时较长，且探针需要纯化，否则会造成杂交背景过深，影响对试验结果的分析研究［11，24］。如本研究采用随机引物法标记的探针未进行纯化，杂交背景较深，且有些单株产生颜色较浅且模糊带型，杂交结果不易明确读取。切刻平移法只适用于双链DNA的标记，对于小片段DNA标记效果不理想［25］。PCR标记方法较其他标记方法而言，操作简便、特异、高效且灵敏度高［26］。PCR标记的探针对模板DNA的质量要求较低，仅需2-10 ng纯度适中的DNA模板即可标记［27］。该方法采用专一的标记酶，价格相对昂贵［6，25］，但单次杂交所需的探针量很少。一次标记可产生50 μL的PCR产物，本研究中单次杂交探针的使用量在0.3 μL/10 mL左右，一次标记可使用150次，不同的探针标记可以按照比例缩小PCR标记的产物量，在一定程度上大大削减杂交成本。PCR法标记的探针灵敏度高于随机引物法，两者相差高达一个数量级甚至更多［24，27，28］，本研究中两者标记的效率相差仅3倍，考虑可能是本研究中随机引物标记探针的起始DNA模板浓度较高，在相同时间内标记的探针产物也较多。本研究室前期一直利用随机引物法对目的基因探针进行标记，存在杂交条带模糊，背景较深，甚至非地高辛标记Marker也可杂交出条带等问题；本试验中利用PCR法标记的探针均未出现上述问题，在一定程度上说明PCR法标记探针其特异性优于随机引物法。从本次研究结果分析，笔者认为橡胶树植株的Southern杂交检测时，PCR法标记法更有优势。

3.2 橡胶树基因组Southern杂交过程中注意事项

3.2.1 DNA的提取方法及酶切 DNA的质量是决定后续Southern杂交顺利进行的关键，高质量的DNA酶切更为彻底、转膜更为充分。本研究室前期采用传统的CTAB法对橡胶树基因组DNA进行提取［29］，存在DNA中混杂一定量的RNA和其他杂质，导致DNA浓度检测不够精准，无法准确计算酶切体系中加入的DNA量，且提取DNA耗时较长，需要约2 d时间。本研究中采用适合富含多糖、多酚类物质的DNA提取试剂盒对橡胶树基因组DNA进行提取，相较传统的CTAB提取方法而言，试剂盒提取的DNA浓度虽然较低，但纯度大幅提高，紫外分光光度计检测的浓度更为准确，酶切体系中加入的DNA模板可准确定量。且DNA提取时间仅需2 h。橡胶树的基因组较大，结构较复杂［12］，同等强度的杂交信号所需的酶切量较大。本研究中高质量DNA样品的酶切量至少在40 μg以上，利用扩大的酶切体系，酶切充分的样品DNA产生若干大小不同的片段，呈现连续的，荧光由深至浅的均匀条带，酶切效果更为理想。酶切产物选用直接加乙醇沉淀［7］，避免酶切产物的损失。

3.2.2 Southern杂交过程中的注意事项 利用地高辛标记的探针进行Southern杂交时，最常见的问题是高背景［30］。本研究中将封闭溶液工作液和抗体溶液工作液孵育时间延长至40 min，非严谨性洗膜采用68℃高温，并延长洗膜时间至20 min×2次。Solanas等［4］认为足够量的地高辛抗体可以获得较好的杂交信号，但是过高的抗体浓度可能会产生多斑点的背景，本研究按照地高辛试剂盒的要求加入抗体，杂交效果较好。Southern杂交加入的探针体积通常为几微升，本研究中将计算加入的探针量预先加入100 μL杂交液中变性，而后将其加入杂交管中，可最大程度减少探针的损失，且可避免高浓度的探针直接黏附在膜上产生黑斑［31］。有文献报道在碱转移结束后无需对尼龙膜上的DNA进行专门的固定［32］，考虑到转移结束后的尼龙膜潮湿不利于保存，且为防止长期保存过程中DNA结合不紧密影响杂交效果，本研究中仍然利用紫外交联仪进行DNA固定。在转基因植株的Southern检测过程中往往需要对同一张膜进行多个探针的杂交，因此探针的剥离尤为重要，在杂交和检测的过程中始终保持尼龙膜的湿润；在用NaOH/SDS处理尼龙膜时，在杂交炉中保证溶液与尼龙膜正面充分接触，并调整杂交炉的转速为中速，减少膜上DNA的损失［33］。

4 结论

本研究针对基因组DNA的提取、PCR法与随机引物法标记探针的比较以及杂交过程中的注意事项等方面对基于地高辛标记的橡胶树Southern杂交技术体系进行了优化。使用DNA提取试剂盒提取的至少40 μg高质量DNA在300 μL的大酶切体系中，酶切12 h可获得良好的效果。利用PCR法标记探针的效率及杂交结果明显强于随机引物法。延长封闭溶液工作液和抗体溶液工作液孵育时间至40 min，非严谨洗膜采用68℃，且延长时间至20 min/次，并将探针预先加入到杂交液中进行变性减少探针的损失和避免膜上产生黑斑等方面进行了优化。

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（责任编辑 李楠）

Optimization of Digoxigenin Based Southern Blot for Transgenic Hevea brasiliensis Analysis

Li Ji1Lu Xu1，2Huang Tiandai1Hua Yuwei1Huang Huasun1
（1. Rubber Research Institute of Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences & Key Laboratory of Rubber Biology，Ministry of Agriculture，Danzhou 571737；2. College of Agriculture，Hainan University，Haikou 570228）

Southern blot technology based on the DIG-chemiluminescent detection has been widely used in numerous species. Using Hevea brasiliensis as materials, the DIG-labeled Southern blot analysis was improved through optimizing several key steps, including extraction of genome DNA, usage of DNA samples amount, digestion system, the comparison between PCR and random-primed labeled method and a serial of procedure in the process of the hybrid. The results showed that desirable digestion result could be achieved when at least 40 μg DNA samples with high quality were enzymed in 300 μL reaction system for 12 hours. The efficiency of probe labeled with the method of PCR was higher than that of probe labeled with random primer obviously, while the Southern blot result of PCR labeled was clear, and the background was lightly, which was conducive to read the copy number accurately. Finally, Southern blot with DIG-labeled was optimized, and good result with high sensitivity and low background was achieved．

Hevea brasiliensis Transgene Southern blot DIG labeling PCR labeled method

2014-03-28

国家自然科学基金项目（31200503），现代农业产业技术体系建设专项（NYCYTX-34）

李季，男，博士，助理研究员，研究方向：橡胶树转基因后代分子检测及橡胶树内源启动子的克隆；E-mail：appleliji@163.com

黄华孙，男，研究员，研究方向：橡胶树种质创新与遗传育种；E-mail：xjshhs@163.com