对虾白斑综合症病毒极早期基因的研究进展

冉晓卓 李钫

（国家海洋局第三海洋研究所 国家海洋局生物遗传资源重点实验室，厦门 361005）

对虾白斑综合症病毒极早期基因的研究进展

冉晓卓 李钫

（国家海洋局第三海洋研究所 国家海洋局生物遗传资源重点实验室，厦门 361005）

对虾白斑综合症病毒（white spot syndrome virus，WSSV）是危害对虾养殖业的主要病原之一。WSSV在侵染宿主细胞的过程中，极早期基因（immediate-early gene）对病毒复制增殖起着非常重要的作用。在这个过程中，一方面极早期基因编码的蛋白通过与细胞调控因子相互作用，调节细胞信号通路，为病毒的增殖提供更合适的环境；另一方面，极早期蛋白直接调控病毒基因的转录和表达。综述列举了WSSV的21个极早期基因，并将重点介绍其中5个研究比较深入的基因：ie1、wsv051、wsv083、wsv249和wsv403。

WSSV极早期基因 ie1 wsv051 wsv083 wsv249 wsv403

对虾白斑综合症病毒（white spot syndrome virus，WSSV）是对虾的主要病原之一，具有极强的感染力和致死性［1］。自从1992年WSSV第一次被科学家检测出，WSSV已经传播至世界各地，对对虾养殖业的发展造成了极大的危害［2］。现有的研究结果表明，WSSV是双链环状DNA病毒，隶属于线性病毒科（Nimaviridae），白斑病毒属（Whispovirus）［3］。对于双链DNA病毒而言，其基因组的表达呈时序性，可分为极早期（Immediate-early），早期（Early）和晚期（Late）。在病毒感染的极早期，没有病毒DNA复制，没有新病毒蛋白合成的情况下，少数病毒基因可以被宿主细胞内的“转录机器”启动，并利用宿主细胞RNA聚合酶II进行转录。这些基因的表达依赖于宿主细胞的转录翻译系统，并且不需要新病毒蛋白的合成，被定义为病毒极早期基因（Immediate-early gene）。极早期基因编码的蛋白，即极早期蛋白，通常是一些调控因子，在病毒的复制过程中对病毒自身和宿主细胞起着非常重要的调控作用。一方面极早期蛋白参与调控病毒早期基因和晚期基因的表达；另一方面，极早期蛋白可以与宿主细胞内的调控因子相互作用，调控宿主细胞的生理状态或者帮助病毒躲避宿主免疫系统的识别和清除，从而为病毒增殖创造合适的环境。例如，疱疹病毒HSV-1极早期蛋白ICP0（Infected-cell protein 0）既可以激活病毒下游基因的表达，也可以与宿主细胞ND10（Nuclear domain 10）结合，破坏ND10的结构，引导细胞内蛋白的降解，干扰宿主的免疫反应［4］。由此可见，极早期蛋白在病毒增殖过程中起着至关重要的作用。

通常实验室中采用抑制细胞内蛋白质合成的方法来筛选病毒的极早期基因。放线菌酮（Cycloheximide，CHX）是一种可以干扰蛋白质合成中的延长步骤而有效地抑制细胞内蛋白合成的化合物。实验中通常将细胞用CHX处理一段时间，阻断新蛋白合成，然后进行病毒感染。病毒极早期基因可以利用已经存在的宿主细胞转录因子及RNA聚合酶II进行转录，所以其转录不会受到CHX处理的影响。而病毒其他基因的转录由于需要病毒极早期蛋白的调控，因此会受到CHX的抑制。利用这个原理，2005年，中国台湾研究人员Liu等［5］第一次用基因芯片技术结合RT-PCR，筛选并鉴定出3个WSSV极早期基因，并将它们命名为ie1、ie2和ie3。2009年，李钫等［6］也利用这种方法鉴定出了16个极早期基因，包括wsv051、wsv069（ie1）、wsv078、wsv079、wsv080、wsv083、wsv091、wsv094、wsv098、wsv099、wsv100、wsv101、wsv103、wsv108、wsv178和wsv249。2011年，林梵宇等［7］使用EGFP作为报告基因检测启动子活性，结合CHX处理实验再次鉴定出wsv056、wsv403和wsv465三个WSSV极早期基因。到目前为止，所发现的WSSV的极早期基因已经达到21个，如表1所示。

尽管对WSSV的研究有了很大的进展，但是人类对WSSV极早期基因的了解仍然有限。目前对WSSV极早期基因的研究主要分为两个方面，一是对于极早期基因转录调控的研究，还有一方面是对极早期蛋白功能的研究。研究的比较多的是WSSV极早期基因ie1、wsv051、wsv083、wsv249和wsv403。

1 对极早期基因iel、wsv051、wsv083、wsv-249和wsv403的相关研究

1.1 对极早期基因ie1的相关研究

ie1是目前研究得最深入的WSSV极早期基因。在病毒入侵宿主细胞的过程中，细胞内的抗病毒机制被激活。在这样的条件下，WSSV极早期基因ie1由于自身的一些特殊结构，能选择性的利用各种调节因子增强自身的表达。同时，ie1编码的极早期蛋白可以通过与其他转录因子相互作用来调节细胞功能。

1.1.1 对WSSV极早期基因ie1转录调控的研究 WSSV极早期基因ie1的启动子具有很强的启动子活性。这种强启动子活性不光存在于宿主细胞内，还存在于非宿主细胞内（sf-9细胞）。曾经有研究者把ie1的启动子活性和CMV（Cytomegalovirus immediate-early）启动子进行过比较发现，在sf-9细胞中，ie1的启动子活性比CMV还要强［14］。这种强启动子活性主要存在于从-92到-74的这一段序列。如果这一段序列发生缺失或者突变，那么启动子的活性丧失。ie1的启动子上存在着一系列的转录因子结合位点，ie1启动子通过与细胞转录因子的作用来增强IE1的表达。

1.1.1.1ie1利用信号转导因子和转录激活因子（Signal transducer and activator of transcription，STAT）增强自身的转录 在宿主细胞中，STAT在宿主抵抗病毒侵染的过程中起着很重要的作用。STAT蛋白中与其功能密切相关的结构包括它的蛋白结合区域，DNA结合区域，SH结合区域和一个C端Tyr残基。当STAT的Tyr残基被磷酸化的时候，STAT被运送到细胞核中，与相关DNA结合，激活下游基因的转录［15］。在这个过程中，JAK-STAT通路（通常认为与细胞内抗病毒机制有关）会被激活，引起氧化应激反应［16］。当WSSV侵入宿主细胞时，STAT本身被活化定位到细胞核中，结合到ie1启动子上STAT结合区域，即从-84到-64的这段序列（ATTCCTAGAAA），直接增强IE1的表达［17］。但是这个结合的过程并不破坏STAT的结构，STAT仍然保持原有的活性，能够激活JAK-STAT通路［18］。上述研究表明，极早期基因ie1可以利用宿主细胞的JAK-STAT通路来增强自身表达。

1.1.1.2ie1利用PHB2增强自身转录 PHB2（Prohibitin 2）蛋白既可以存在于线粒体内，也可以存在于细胞核内。在脊椎动物细胞中它可以作为共作用因子通过与其他转录因子的相互作用来调节下游基因的转录活性［19］。研究表明，在对虾细胞中，PHB2的C端存在一个DNA结合位点（Helix-turnhelix domain，HTH domain），因此它还可以作为转录因子直接结合到ie1启动子上调节基因转录。ie1启动子的-78到-66这一段序列可以与PHB2的HTH domain结合，增强IE1的表达［20］。

1.1.1.3ie1利用NF-κB增强自身转录 IKKβ（IκB kinase β）和IKKε（IκB kinase ε）是NF-κB（Nuclear factor κB）通路最关键的调控因子。NF-κB通路的活化涉及到一系列的磷酸化和泛素化反应，释放出炎症因子，召集相关的免疫细胞来清除入侵的病原体。IKKβ通过调节IκBα（Inhibitor of NF-κBα）的磷酸化，开启NF-κB通路。IKKε 则是通过调节细胞内的AMP（Antimicrobial peptide genes）表达，开启NF-κB通路［21］。IKKβ和IKKε的过表达都会导致NF-κB通路的活化。研究表明WSSV可以利用IKKNF-κB信号通路来促进病毒基因的转录，其中包括了极早期基因ie1、wsv051和wsv083［22］。体外实验已证实对虾的NF-κB同源蛋白LvRelish可以直接结合到ie1启动子上，激活ie1转录［23］。

1.1.2 对极早期基因ie1编码的蛋白的研究 WSSV极早期蛋白IE1是由极早期基因ie1编码的蛋白，全长224个氨基酸。在IE1上面存在着多个蛋白结合位点和DNA结合位点。在C端有DNA结合位点和硫氧化还原蛋白（Thioredoxin，Trx）结合位点，在靠近N段的位置有TATA box结合蛋白（TATA-binding protein，TBP）和成视网膜瘤蛋白（Retinoblastoma protein，RB）结合位点。IE1可以通过与细胞转录因子结合，参与调节细胞内各种生化反应。

1.1.2.1 IE1具有转录因子的特性 很多病毒极早期基因可以编码转录调节因子来调节下游基因的表达。转录因子通常具有以下功能结构域：DNA结合结构域（DNA binding domain，DBD）和转录激活结构域（Transactivation domain，TAD）。DBD可以使转录激活因子结合到目标序列上，TAD可以和转录机器相互作用促进目标基因的转录。研究表明，IE1同时具有转录激活和DNA结合的能力，其转录激活结构域存在于蛋白质C端前80个氨基酸中，而DNA结合结构域位于C端第81个氨基酸到第224个氨基酸之间。此外当IE1与DNA结合时，IE1可以自身发生相互作用，形成二聚体［24］。因此IE1可能以同源二聚体形式发挥转录调节的作用。

1.1.2.2 IE1与对虾TATA box结合蛋白PmTBP结合促进病毒基因的表达 在真核细胞中，转录因子TFⅡD（Transcription factorⅡD）对于DNA的转录是必须的。TFⅡD由一个TATA box结合蛋白（TATA-binding protein，TBP）和TBP相关因子（ TATA-binding protein associated factors，TAFs）组成［25］。根据现有的研究表明，很多病毒极早期蛋白，如腺病毒的E1A（A viral oncoprotein of adenvirus）和疱疹病毒的Zta（A viral transcription factor of EBV）都是通过与TBP的结合来促进自身的转录［26，27］。WSSV 极早期蛋白IE1也可以与对虾TATA-box结合蛋白（Penaeus monodonTATA box-binding protein，PmTBP）结合。IE1的81-180位氨基酸可以分别与PmTBP的171-230位和111-300位氨基酸发生相互作用。RNA干扰实验证明，这种结合促进了病毒早期基因DNA polymerase gene的表达，因此IE1和PmTBP的相互作用能够影响病毒在宿主细胞内的增殖［8］。

1.1.2.3 IE1可以与成视网膜瘤蛋白结合调节细胞周期 成视网膜瘤蛋白（Retinoblastoma protein，RB）是调控细胞周期的关键蛋白，RB与E2F转录因子的相互作用可以调控细胞周期从G0/G1期进入S期。当RB与E2F结合形成蛋白复合体时，E2F的活性被抑制；当RB与某些调控蛋白结合后，RB-E2F复合体解离，释放出E2F蛋白，使之能够结合到靶基因的启动子上，启动下游基因的转录［28］。E2F调控的下游蛋白通常与细胞周期调控有关，包括 DNA polymerase subunitⅡ、PCNA（Proliferating cell nuclear antigen）、Thymidilate synthetase，cdc2、cyclin E、UNG（Uracil-N-glycosylase）、BRCA1（Breast cancer 1）、MCM2（Minichromosome maintenance protein 2）和MCM6（Minichromosome maintenance protein 6）［29］。这些蛋白的表达会促使细胞从G0/G1期进入S期。对WSSV的研究表明，IE1蛋白可以通过其C末端的“LxCxE”结构域与RB结合；这种相互作用导致RB-E2F复合体的解离，使E2F活化。活化的E2F调节下游基因的表达，从而导致宿主细胞从G0/G1期进入S期［9］。

1.1.2.4 硫氧化还原蛋白可以修复IE1结合DNA的能力 硫氧化还原蛋白（Thioredoxin，Trx）是一个12 kD大小的蛋白，其主要的功能是氧化还原。实验证明，在WSSV感染细胞48 h后，细胞内谷胱甘肽含量明显下降，细胞内产生大量的活性氧，IE1遇到活性氧被氧化，丧失了结合DNA的能力。被氧化的IE1可以与Trx结合，结合的位点是在62位的Cys。IE1通过与Trx的结合可以修复IE1结合DNA的能力，恢复其原有的功能，有利于病毒的增殖［30］。

1.2 对极早期基因wsv051的相关研究

极早期基因wsv051经过转录翻译后产生极早期蛋白WSV051。WSV051是一个由196个氨基酸组成的蛋白，科学家推测其可能是一个转录因子。WSV051蛋白中存在两个小泛素相关修饰（Small ubiquitin-like modification，SUMOylation）位点。小泛素相关修饰是一种翻译后蛋白共价修饰，对蛋白功能起着微调的作用。E2结合酶UBC9（SUMO ubiquitin-conjugating enzyme 9 ）是小泛素相关修饰过程中最重要的蛋白分子［31］。在该过程中，活化E1激活酶后，小泛素样修饰蛋白（Small ubiquitin-like modifier，SUMO）小分子转移到UBC9的第93位Cys，然后SUMO从UBC9传递到底物上［32］。很多病毒极早期蛋白，如疱疹病毒极早期蛋白IE2，通过参与SUMO化，调节细胞内活动［33］。在WSSV侵染的过程中，极早期蛋白WSV051被UBC9调节的SUMO化作用修饰，这一修饰可以避免该蛋白被细胞内的泛素化途径降解。RNA干扰结果证明如果UBC9或者SUMO的表达受到抑制，则WSSV早期和晚期基因的表达也会受到抑制。根据这个结果科学家推测WSV051通过SUMO化修饰延长自身在细胞中的半衰期，进而可能促进病毒早期和晚期基因的表达，有利于WSSV在宿主细胞内的增殖［10］。

1.3 对极早期基因wsv083的相关研究

1.3.1 对极早期基因wsv083转录调控的研究wsv-083的启动子含有一段TGACGT（G/C）A的序列，可以与对虾的XBP（X-box binding protein 1）蛋白结合启动下游基因的转录。内质网是细胞内负责蛋白的折叠以及蛋白的修饰的细胞器。当病毒入侵宿主细胞的时候，在内质网中会产生大量无法正常折叠的蛋白，这种由外部干扰因素导致内质网功能失常的现象，称为内质网压力（ER-stress）［34］。真核生物细胞中存在一套完整的非折叠蛋白反应机制（Unfolded protein response，UPR）来应对内质网压力。UPR涉及3个信号转导途径：（1）IRE1-XBP1通路（Inositol-requiring 1/X box binding protein 1 pathway）；（2）PERK-eIF-2α通路（Double-stranded RNA-activated protein kinase（PER）-like endoplasmic reticulum kinase/Eukaryotic initiation factor 2α pathway）；（3）ATF6通 路（Activating transcription factor 6 pathway）［34，35］。UPR通过减少蛋白的翻译、增加分子伴侣表达，促进错误折叠的蛋白降解［36］等途径来减少细胞内非正确折叠的蛋白的含量，保持细胞活力。实验证明，在WSSV侵染宿主细胞的过程中，LvXBP是对虾细胞内最主要的UPR通路调控因子。LvXBP含有一个BRLZ功能结构域，可以促进极早期基因wsv083的转录。因此，WSSV可能通过调节UPR通路，选择性的使用UBP转录因子来增强自身基因的表达［37］。

1.3.2 对极早期基因wsv083编码的蛋白的研究 WSV083是一个由581个氨基酸组成的蛋白，含有Ser/Thr磷酸化激酶功能结构域。实验表明WSV083可以通过抑制Tyr的磷酸化，降低FAK的活性。由于FAK是一种与细胞黏附性有关的蛋白，FAK活性的降低会导致细胞黏附性的下降。而无脊椎动物细胞的黏附性在免疫机制中起着重要的作用。因此，WSV083对FAK通路的调控可能使病毒更加容易攻击宿主免疫系统［11］。

1.4 对极早期基因wsv249的相关研究

极早期基因wsv249经过转录翻译后产生极早期蛋白WSV249。WSV249是一个由783个氨基酸组成的蛋白。通常在真核细胞中，依赖泛素的蛋白水解是用来调控蛋白丰度，从而在细胞周期，信号转导，转录调控，DNA修复和炎症反应等过程中起到调节作用［38］。在泛素化过程中，通常会有3种酶参与作用，它们分别是泛素活化酶E1（Ubiqutin-activating enzyme），泛素结合酶E2（Ubiqutin-conjugating enzyme）和泛素连接酶E3（Ubiqutin-ligase enzyme）［38］。通常E3连接酶都是含有环指结构（Ring finger）的蛋白，而环指结构又分为两大类RING-HC和RING-H2［39，40］。WSV249含有RING-H2结构域，可以与PvUbc（Ubc homology inPenaeus vannamei）结合，使底物泛素化，因此是一种泛素连接酶［12］。许多病毒能够直接利用细胞内的泛素化途径降解细胞内蛋白，从而有利于自身的增殖［41］。因此WSV249可能在WSSV感染中起到类似的作用。

1.5 对极早期基因wsv403的相关研究

极早期基因wsv403经过转录翻译后产生极早期蛋白WSV403。WSV403是一个由641个氨基酸组成的蛋白，包含了一个RING-H2环指结构，也是一种E3泛素化连接酶，可以被E2泛素结合酶活化。实验表明wsv403是一种与病毒潜伏期有关的基因，该基因在潜伏期和复制期皆有表达，而且随着复制感染的进程表达量逐渐提高。鉴于WSV403可以和对虾细胞内蛋白磷酸酶（Protein phosphatase，PPs）结合，研究者推测WSV403的表达有可能通过影响细胞内蛋白的磷酸化水平来对病毒潜伏期-复制期的转换进行调控［13］。

2 对WSSV极早期基因启动子的研究

目前，除了对WSSV极早期基因转录调控和结构功能有所研究外，对极早期基因启动子活性的研究也有一定的进展。正如前面提到的在2008年就有研究者把ie1的启动子活性和CMV进行比较发现ie1的启动子活性在某些细胞内比CMV强［14］。在2011年，林梵宇等［7］采用EGFP作为报告基因筛选极早期基因发现，wsv056、wsv403和wsv465的启动子可以直接被细胞内转录因子激活。随后在2013年，他们对现有极早期基因的启动子做了详细的分析，使用EGFP作为报告基因结合流式分析技术，通过构建突变体找出这些启动子的核心区域。在这篇报告中，他们确定了8个核心功能区域，其中cyclic AMP respnse element（CRE），即TGACGTCA这一段序列，在这些调控区中出现频率很高。如果CRE功能结构域发生突变，wsv403和wsv465的启动子活性就会丧失。这说明CRE元件在极早期基因转录上有着重要的作用［42］。

3 结语

经过20多年的研究，人们对WSSV的形态结构、基因组、结构蛋白组组成等方面有了较深入的认识，但是对WSSV感染调控机制的研究还处于起步阶段。极早期蛋白是DNA病毒中最主要的一类调控因子，现有研究结果表明，一些WSSV极早期蛋白能够与细胞内的调控因子相互作用，调节细胞的生理生化过程，为病毒的增殖创造良好的环境。此外，WSSV极早期基因可以选择性的利用细胞内的转录因子增强自身的转录。鉴于极早期蛋白是病毒增殖过程中一类重要调控因子，对WSSV极早期基因功能的深入研究有助于揭示WSSV的感染机制，并能够为抗病毒药物的设计奠定理论基础，为WSSV的防治，减少对虾养殖产业造成损失作出贡献。

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（责任编辑 狄艳红）

A Review of Development in WSSV Immediate-early Gene Research

Ran Xiaozhuo Li Fang
（Third Institute of Oceanography，Key Laboratory of Marine Genetic Resourse，State Ocean Administration，Xiamen 361005）

White spot syndrome virus is one of the main pathogens which causes great damage to the shrimp aquaculture. During the infection, WSSV immediate-early genes（IE genes）utilize the host cell transcription regulators to increase their own transcription. Regulatory proteins encoded by IE genes are critical for the virus life cycle. The IE proteins may either regulate the expression of viral genes, or interact with regulators in the host cells to create a proper environment for viral replication. Here we reviewed the recent progress in WSSV IE gene research and especially focused on five most-studied WSSV immediate-early genes：ie1, wsv051, wsv083, wsv249 and wsv403. The function of IE proteins and the transcription regulation of their genes were discussed.

WSSV immediate-early genes ie1 wsv051 wsv083 wsv249 wsv403

2013-12-26

国家自然科学基金资助项目（41276176）

冉晓卓，男，硕士研究生，研究方向：对虾白斑综合症病毒极早期基因；E-mail：absolut21@126.com

李钫，女，副研究员，研究方向：对虾白斑综合症病毒极早期基因；E-mail：lifang@tio.org.cn