小RNA病毒3C蛋白酶及其裂解底物

刘艳李冰清孟红

（1.山东省医学科学院基础医学研究所微生物学研究室，济南 250000；2.济南大学 山东省医学科学院医学与生命科学学院，济南 250022）

小RNA病毒3C蛋白酶及其裂解底物

刘艳1，2李冰清1孟红1

（1.山东省医学科学院基础医学研究所微生物学研究室，济南 250000；2.济南大学 山东省医学科学院医学与生命科学学院，济南 250022）

小RNA病毒科是一类大的动物病毒科，小RNA病毒蛋白的合成需要自身蛋白酶裂解形成多个结构蛋白和功能蛋白，3C蛋白酶是一些小RNA病毒的自身蛋白水解酶之一，3C蛋白酶还可以裂解一些宿主的蛋白，利于病毒的复制。3C蛋白酶结构特点、活性中心、酶切位点如何，裂解的底物功能怎样，是进一步了解3C蛋白酶作用机制的关键。就这些问题进行综述。

小RNA病毒 3C蛋白酶 裂解底物

小RNA病毒科包含5个属：肠道病毒属、鼻病毒属、心病毒属、口蹄疫病毒属和肝病毒属。小RNA病毒含有开放性读码框架，指导病毒利用宿主蛋白合成系统转编码一个大的多聚蛋白，经过自身蛋白酶的切割，将蛋白前体水解为4个衣壳蛋白和多个功能蛋白。3C蛋白就是一些小RNA病毒的自身蛋白水解酶之一，它虽然不直接参与病毒RNA的复制，但是它对多种前体蛋白的正确水解有力的保证了衣壳的形成和病毒的复制。3C蛋白酶不仅裂解自身蛋白，也可以裂解宿主的细胞内的蛋白，包括一些转录因子、翻译因子、固有免疫信号分子及细胞的骨架蛋白，能够抑制宿主蛋白的合成或功能的发挥、保证病毒的复制，还能使病毒逃避宿主的固有免疫，细胞骨架蛋白的重组有利于病毒的扩散及释放。据文献报道，3C蛋白存在于以下小RNA病毒中，如肠道病毒71型（Enterovirus 71，EV71）、脊髓灰质炎病毒（Poliovirus，PV）、柯萨奇病毒（Coxsackievirus，CV）、人鼻病毒（Human rhinovirus，HRV）、脑心肌炎病毒（Encephalo myocarditis virus，ECMV）、口蹄疫病毒（Foot and mouth disease virus，FMV）、甲肝病毒（Hepatitis A virus，HAV）等。在以上病毒中，3C蛋白酶结构特点、活性中心、酶切位点如何，裂解的底物的名称及功能怎样，是进一步了解3C蛋白酶作用机制的关键。以下就这些问题进行综述。

1 3C蛋白酶的特点

小RNA病毒的3C蛋白酶是分子量约为20 kD的蛋白酶。氨基酸链先形成6个β折叠片，进而折叠成2个β折叠桶的结构域（Domain），底物结合存在于这两个domain结合的凹槽中。3C蛋白酶是具有S（丝氨酸）/C（半胱氨酸）性质的蛋白酶，它们都是以Cys-His为活性中心，主要区别在于活性中心第3个氨基酸不同。其中，EV71、CVB、PV、HRV的活性中心是Cys-His-Glu，HAV的活性中心是Cys-His-Tyr，FMDV的活性中心是Cys-His-Asp，3C蛋白酶的结构和活性中心，如图1所示［1-9］。

2 3C蛋白酶裂解的底物

2.1 3C蛋白酶裂解的底物介绍

已有文献报道3C裂解的宿主底物有近19种，这些底物多为转录和翻译过程中的转录因子、翻译因子及固有免疫信号通路中的某些关键蛋白，还涉及到一种细胞骨架蛋白。

2.1.1 转录因子 真核生物在转录的起始阶段，需要RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ依赖于转录因子与启动子结合，形成转录起始复合物。TBP、TFⅡD、PARP、TFⅢC分别是RNA聚合酶Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ的转录因子，据文献报道，PV的3C裂解上述转录因子，阻止转录复合物的形成，进而影响宿主蛋白的合成［10-13］。H3作为真核生物染色体的基本结构蛋白，组蛋白的乙酰化修饰能招募RNA聚合酶Ⅱ到启动子上辅助RNA转录，Tesar等［14］研究发现FMDV的3C裂解H3，导致宿主转录的关闭。Oct-1也是一个负性调节DNA依赖的基因转录、RNA聚合酶III启动子的转录因子。有研究发现，PV的3C能裂解Oct-1，机制是Qct-1-DNA复合物丢失Oct-1，Oct-1结合到SV40B增强子的八聚体上，抑制SV40B增强子的转录激活、Sph介导的下游TATA启动子等转录［15］。CREB能与结合在启动子和增强子的cAMP反应元件结合，作为一种转录增强子，PV的3C裂解CREB，使其丧失了结合DNA和转录活性，RNA聚合酶II等转录受到抑制［16，17］。众所周知，P53是一个细胞癌抑制基因，它也作用于RNA多聚酶Ⅱ转录，Weidman等［18］研究报道，P53是3C的间接裂解产物，P53的裂解不仅导致转录的关闭，还导致凋亡的延迟，有利于确保病毒颗粒的加工和释放。

2.1.2 mRNA的加工因子 真核生物在mRNA的加工过程中涉及到5'端加帽、3'端加尾、mRNA前体的剪切及编辑。CstF64与3'末端的polyA尾断裂有关，Weng等［19］研究发现EV71的3C裂解此蛋白抑制了宿主的多聚腺苷酸化，mRNA的加尾信号受到影响。FBP2是宿主细胞中含有内部核糖体进入位点（Internal ribosome entry site，IRES）的反式作用因子，也具有mRNA的剪切功能，IRES是EV71翻译的起始位点，FBP2能下调病毒的IRES活动［20］。Chen等［21］研究发现，EV71的3C裂解掉FBP2的C端，导致FBP2不能发挥原有的负向调节功能，反而将FBP2变为正向调节功能，此裂解过程有力的保证了IRES有效指导病毒基因组翻译的功能发挥。

2.1.3 翻译因子 真核生物的翻译起始阶段是先形成起始复合物，起始复合物的形成需要eIF2（GTP结合蛋白）、eIF4A（依赖于RNA的ATP酶）、eIF4G（起连接组合作用的亚基）、eIF4E（帽结合蛋白）和PABP等帮助下形成40S亚基-Met-tRNAiMet复合物，沿着mRNA向3'端方向滑动扫描。eIF5是ATP水解酶，它还促使eIF2和eIF3从核糖体40S亚基解离，随后60S核糖体亚基与40S-mRNA-Met-tRNAiMet结合形成80S起始复合物，起始蛋白的合成。

目前有很多关于小RNA病毒，如FMDV、HRV、CVB3的3C裂解一些翻译因子，如eIF5B、eIF4GⅠ、eIF4AⅠ及PABP的报道。Li等［22］报道，FMDV 3C裂解eIF4AⅠ，影响eIF4AⅠ的ATPase功能的发挥，阻碍了其ATP结合活动和解旋酶活动。Strong等报道FMDV 3C裂解了eIF4G不仅抑制了蛋白合成，且eIF4G的C端的片段裂解下来后能与病毒的IRES结合，可用于指导病毒的翻译［23，24］。PV、CVB、HRV的3C将eIF5B的N端和中央GTPase及C端的domain裂解，不仅导致eIF5B在核糖体亚基中GTP依赖的活动受抑制，还影响它与48S复合物的结合和从组装好的80S核糖体的释放［25］。Kuyumcu-Martinez 等［26-28］发现，EV和杯状病毒的3C裂解PABP，关闭了宿主的翻译过程，作者将裂解位点定位于C端。Zhang等［29］研究认为，3C裂解PABP，由于PABP的N端的裂解产物含有IRES的负向调节组分，因而抑制了HAV的IRES介导的帽依赖的翻译。Bonderoff 等［30］也指出，PABP能与PV的PolyA 尾结合，刺激IRES依赖的翻译，3C裂解PABP将导致病毒丢失这种刺激IRES翻译的功能，影响病毒RNA复制的起始。2012年，Kobayashi等［31］鉴定出EMCV的3C 裂解PABP位点位于Q437G。

2.1.4 固有免疫信号分子 3C还裂解固有免疫的信号分子，如TRIF、IRF7，NEMO和MAVS等，减少了Ⅰ型干扰素的产生，使病毒逃避宿主固有免疫。Lei等［32］发现，EV71的3C通过裂解TRIF削弱Ⅰ型干扰素的产生，抑制TLR3介导的抗病毒反应，其裂解位点位于N端Q312S，此位置的附近是肿瘤坏死因子受体相关因子6（Tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6） 结 合 区域。NEMO是众多信号通路的泛素联结分子，Wang等［33］发现，FMDV的3C将其C端锌指结构裂解下来，抑制了干扰素等产生。MAVS是定位于线粒体内膜上的抗病毒蛋白，N端CARD结构域和RIG-I的CARD结构域结合，传递下游信号。研究报道CVB 3C裂解MAVS的脯氨酸丰富区和TRIF，影响I型IFN产生［34］。EV71的3C还可以直接裂解IFR7，使得病毒逃避了宿主的固有免疫［35］。

2.1.5 细胞骨架蛋白 3C蛋白裂解一种细胞骨架蛋白MAP4。MAP4在微管的滑行、有丝分裂纺锤体的定向和组织、细胞分化中起作用。Joachims等［36］研究PV的3C蛋白酶介导MAP4的裂解，使得细胞骨架重组，有利于增加细胞溶解，病毒释放。

2.2 3C裂解宿主底物和自身底物的特点

2.2.1 3C裂解宿主底物的特点 宿主底物现在已知有明确裂解位点的宿主底物有11种，如表1所示。分析裂解位点，很容易发现3C切割的位点具有特异性，EV71、PV、CVB3、EMCV和HRV的特异裂解位点都位于Q-G/S之间，切割位点前第4位氨基酸大部分是A。而FMDV的裂解位点位于Glu-Val/Pro、Gln-Arg、Leu-Ala之间。可见，EV71与FMDV差别较大。EV71与PV、CVB3、EMCV、FMDV、HRV和HAV的3C蛋白的同源性，分别为：72%、57%、99%、40%、62%和50%，与EV71的3C蛋白同源性最高的是EMCV，最低的是FMDV，这也恰好解释了EV与FMDV的裂解位点差别最大的现象。

2.2.2 3C蛋白酶裂解自身底物的特点 那么3C裂解自身的蛋白是否也是集中于以上几个位点，表2列出差别较大的EV71和FMDV的3C裂解的自身蛋白的序列，EV71的自身裂解位点仍旧是Q-G/S，而FMDV的自身裂解位点则集中于E-G/S/T或者Q-L/I/T。目前还未明确裂解位点的底物有8种，大部分报道是有关肠道病毒属的3C蛋白裂解底物，如表3所示。

3 总结

小RNA病毒感染给国民生命财产安全和畜牧业发展带来的重大损害不容忽视，EV71、PV、EMCV等病毒感染机体后严重者可导致引起神经系统的并发症；HRV常常是病毒性感冒的病原体之一；FMDV是引起口蹄疫的主要病原体。3C蛋白酶存在于小RNA病毒科的上述多个病毒属中，尤其裂解宿主蛋白的功能对于抑制宿主蛋白的合成和功能发挥、保证病毒蛋白有效翻译、逃避固有免疫的监控，病毒颗粒的穿入和释放中有重要的意义。虽然仍有一些3C裂解的宿主蛋白尚未被发现特异的裂解位点，如FBP2、MAVS、PARP、TFⅢC、TFⅡD、CREB、Oct-1、MAP4，这些蛋白需要我们进一步通过体内外实验验证3C蛋白与它们的裂解关系是直接的还是间接的，并寻找出裂解的特异位点，但是3C蛋白酶作为病毒自身蛋白和宿主多个蛋白的关键蛋白水解酶，在小RNA病毒致病机制中的意义是不容置疑的。作为小RNA病毒中的众多病毒属中的共同蛋白水解酶，研究抑制3C蛋白酶的药物应用前景广阔。可以预见的是，3C蛋白酶的研究将会在重大病毒性疾病的攻克方面，如手足口病、口蹄疫、病毒性心肌炎、甲型肝炎、病毒性感冒、病毒性咽峡炎等有重要的指导价值。相信在未来的发展中，小RNA病毒的蛋白酶学研究领域和应用前景将更加广泛和深入。

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（责任编辑 狄艳红）

Research of 3C Protease Picornaviruses and Its Cleavage Substrates

Liu Yan1，2Li Bingqing1Meng Hong1
（1. Department of Microbiology，Institue of Basical Medicine，Shangdong Academy of Medical Sciences，Ji'nan 250000；2. School of Medicine and Life Sciences，Shangdong Academy of Medical Sciences and Ji'an University，Ji'nan 250022）

Picornavirus is a big family of animal viruses, viral protein synthesis needs its own proteases’ cleavage to form sructural and functional proteins. 3C protease is one of picornaviruses’ own proteases. 3C can also cleave some host proteins to benifit viral replication. 3C protease’s structural characteristics, active center, cleavage sites and cleavage substrates’ functions are key of further understanding 3C protease mechanism. Here follows the review on these issues.

Picornavirus 3C protease Cleavage substrates

2014-01-28

国家自然科学基金项目（81000720）

刘艳，女，研究方向：病原生物学；E-mail：lychasedream@163.com

孟红，女，教授，研究方向：病原生物学；E-mail：menglc@163.com