肌肽预处理对缺氧缺血后大鼠认知功能的影响

张香敏，张展，程秀永，徐发林，贾天明，栾斌，贾莉婷

围生期缺氧导致的新生儿缺氧缺血性脑损伤(hypoxic ischaemic brain damage，HIBD)是新生儿科的常见病和多发病，发病重，病死率高。近年来，随着新生儿重症监护病房的建立，死亡率较前降低，但重度窒息新生儿存活者中神经系统后遗症如智力障碍、神经行为问题、脑性瘫痪等发生率较前上升，给家庭和社会带来了沉重的经济负担和社会负担，是值得关注的社会问题，也是目前广大儿科医务人员研究的热点问题。

有研究证实，肌肽对缺血性脑损伤、缺血再灌注性脑损伤等具有神经保护作用[1-3]，但肌肽是否对缺氧缺血(hypoxic ischaemic，HI)性脑损伤具有神经保护作用，目前未见报道。本研究旨在对7日龄大鼠制作HI模型，通过Morris水迷宫实验，探讨肌肽对HI大鼠认知功能的影响，从而推断肌肽是否对HI大鼠具有神经保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 7日龄清洁级SD大鼠(证书编号：SCXK(沪)2008-0016)，雌雄不拘，体质量12～18 g，均购自中科院实验研究实验室，并经复旦大学动物伦理委员会批准，按照实验动物有关保护条例进行，在研究期间新生大鼠与母鼠在同一笼内饲养，光照时间12 h，自由摄食水。

1.2 方法

1.2.1 实验分组及给药方法 将36只SD大鼠按随机数字表法分为3组,每组12只,(1)肌肽预处理组：在HI诱导前30 min腹腔注射肌肽1次250 mg/kg[4，5]；(2)HI组：在相同条件下用等容积的生理盐水代替；(3)假手术组：不接受任何治疗和处理。

1.2.2 HI模型制作 在室温(25±2)℃环境下，将大鼠四肢及头部固定在手术台上，吸入无水乙醚诱导麻醉；皮肤常规消毒后小心剪开颈部皮肤，逐层分离暴露左侧颈总动脉并小心分离迷走神经，用4个0号外科丝线双线结扎该动脉并从中间剪断，造成永久性断流。此后将大鼠放回到母鼠身边恢复1.5 h，氧氮混合气体(8%氧气/92%氮气)缺氧箱中持续通入湿化的氮氧混合气2 h，缺氧结束即制成7日龄大鼠HI脑损伤动物模型。假手术组动物与HI组动物来自同一窝动物，动物置于相同条件下，既不结扎血管阻断血流，也不置于缺氧箱里缺氧，皮肤切一小口，仅分离左侧颈总动脉。建模完成后动物放回母鼠笼内，并送回动物房，由专人饲养。

1.2.3 Morris水迷宫实验步骤 大鼠28～33 d时通过Morris水迷宫测试系统评价其空间学习和记忆能力，参考以前的方法并作小的修改[6]。每日9：00～16：00进行，以尽量保证实验条件的均衡。(1)Morris水迷宫系统：本系统包括一个盛有水的黑色圆形水池(水池的直径1.8 m，深度65 cm，水深27.5 cm，水温(25±2)℃左右)，为了突出水中的目标，水用墨汁染黑，以便于摄相机的跟踪。池中隐藏在水下2 cm的半透明的站台一个(10 cm×10 cm)；一套图像采集与处理系统(摄像机、录像机、显示器和分析软件等)。所有实验均在一安静的屏蔽室内进行，为了避免可能利用的视觉提示，水池周围的白色窗帘在实验时被放下。正式实验的前一天让动物在撤离平台的水池内适应性训练1次，实验者不了解大鼠的分组情况。(2)经典的Morris水迷宫实验分为定位航行实验和空间探索实验两个部分。定位航行实验：历时5 d，每次将大鼠面向池壁分别从4个不同象限的入水点放入水中，记录其寻找到隐藏在水面下站台的时间即逃避潜伏期和找到站台前游泳的距离以及游泳的速度，每次120 s。如果大鼠在规定时间内不能找到站台，测试者直接把大鼠放到站台上停留30 s，以加强大鼠的记忆。然后以同样的方法再测试下一只大鼠。每次训练间隔1 min。空间探索实验：在定位航行试验结束后的次日(第6天)撤去平台，然后选择离站台最远的入水点将大鼠面对池壁放入水池中。记录其在一定时间内的游泳轨迹，考察大鼠对隐藏站台位置的记忆情况。测试时间为30 s。记录其在目标象限停留时间的百分比，此参数是空间记忆的特别测试。连接到水池正上方的计算机跟踪软件记录实验的全过程。实验参数包括：大鼠的游泳时间、游泳距离及在目标象限游泳时间的百分比。

2 结果

2.1 各组大鼠在Morris水迷宫定位导航测试中游泳时间和距离的比较 见表1、2。

表1 各组大鼠在Morris水迷宫定位导航测试中游泳时间的比较

注：与HI组比较,aP<0.05。

表2 各组大鼠在Morris水迷宫定位导航测试中游泳距离的比较

注：与HI组比较,aP<0.05。

在评价与大鼠学习能力有关的Morris水迷宫定位导航测试中，HI组动物的游泳时间明显大于肌肽预处理组，差异有统计学意义(P<0.05)；其游泳距离亦相应增加，差异有统计学意义(P<0.05)；肌肽预处理组较HI组减少了HI动物的游泳时间及距离，差异有统计学意义(P<0.05)；而游泳时间和游泳距离在肌肽预处理组和假手术组之间差异无统计学意义(P>0.05)；此外，肌肽预处理后各组动物游泳速度之间的差异亦无统计学意义(P>0.05)。

2.2 肌肽预处理对大鼠在目标象限游泳时间百分比的影响 在评价与大鼠记忆能力有关的Morris水迷宫探索实验中，预处理组大鼠在目标象限游泳时间所占百分比为(27.75±4.04)%，HI组为(19.75±2.80)%，假手术组为(29.00±4.37)%。3组比较差异有统计学意义(F=20.93，P<0.001)，预处理组与HI组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。

3 讨论

评价有关空间学习和记忆认知测试的方法有很多[7-9]，但Morris水迷宫是公认的评价与认知功能有关的空间学习和记忆能力的标准测试系统[10-13]，Morris水迷宫是一种应激性测试，能较准确的反映学习和记忆能力，这一特点已经在一个研究中得到证实[14]。该实验包括定位航行实验和空间探索实验；定位航行实验评价空间学习能力，评价指标包括游泳时间和游泳距离，学习能力下降时，游泳时间延长，游泳距离增加；空间探索实验评价记忆能力，评价指标是目标象限游泳时间的百分比。而且，有关研究已经证实海马和大脑皮质与学习和记忆能力有关，神经元损伤可导致认知功能下降[10，12，15-20]。有研究表明：海马CA1区的神经元比CA3区神经元明显敏感，因为海马CA1区含有比CA3区神经元较高的超氧阴离子[21]。而且，从CA1区神经元分离的线粒体比CA3区释放更多的ROS[22]，所以海马CA1区对HI较敏感。生后28～33 d的大鼠按照脑发育的过程来讲其相当于2岁左右的幼儿[22]，这一阶段是学习和记忆的关键时期。因此，本研究选择生后28～33 d的大鼠作为研究对象，评价学习和记忆能力。

曾经有研究报道，肌肽对转基因缺血大鼠的认知功能无明显影响[23]。本研究结果表明，肌肽预处理降低了HI大鼠的游泳时间和游泳距离，增加了大鼠在目标象限游泳时间的百分比，因此改善了由于HI导致的远期空间学习和记忆能力下降，结果与文献报道不一致，分析其原因可能是由于模型不同，鼠龄不同有关。本课题组曾经通过TUNEL染色证实肌肽预处理后HI大鼠大脑皮质和海马CA1区的TUNEL阳性细胞数明显减少。肌肽预处理后海马和大脑皮质神经细胞凋亡减少与改善HI大鼠认知功能有关[24]。

总之，肌肽预处理不仅改善由于HI诱导的脑损伤的生理和病理变化，而且也改善了HI大鼠的远期认知功能。这些结果表明：肌肽有可能成为一个有前途的脑损伤神经保护药物，并有可能为临床脑损伤的治疗开辟新的途径。

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