microRNA的检测技术及其法医学应用前景

王正，张霁，唐丹舟，王彦斌，侯一平

（1.四川大学华西基础医学与法医学院法医遗传学教研室，四川成都610041；2.中国合格评定国家认可中心，北京100062）

microRNA（miRNA）是一类长度为18~25个核苷酸构成的非编码小分子RNA，在转录后水平调控基因表达[1-2]。在哺乳动物细胞中，miRNA基因主要由RNA聚合酶Ⅱ/Ⅲ转录生成初级转录物pri-miRNA，经过两次剪切生成成熟的miRNA[1-3]。第一次剪切发生在细胞核内，在RNaseⅢDrosha的作用下，pri-miRNA被剪切成70bp左右并具有茎环结构的前体miRNA（premiRNA），再经Ran-GTP依赖性核浆转运子Exportin5转运至细胞质，在RNaseⅢDicer作用下被剪切成22bp左右的miRNA/miRNA*二聚体。成熟的miRNA整合到RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）并通过识别靶mRNA发挥生物学功能。miRNA与mRNA结合的互补程度决定miRNA的作用，几乎完全互补时引起类似RNA干扰（RNAi）的剪切作用，互补程度较低时则导致翻译抑制作用[1-3]。人类基因组中只占1%的miRNA却调控着1/3的基因表达[4]，参与调节细胞发育、分化、增殖、凋亡等生理过程，以及肿瘤发生发展、心脏病、糖尿病等病理过程[5-7]。研究[8-10]表明，miRNA的表达具有高度保守性、时序性和组织特异性。基于miRNA的生物学功能和表达特点，其在法医学体液鉴定、种属鉴定和死亡时间推断等方面具有潜在的法医学应用前景。本文就miRNA的检测方法及其法医学应用价值进行综述。

1 miRNA的检测方法

成熟miRNA片段短、GC含量差别大、缺乏共同的序列特征、序列同时存在于pri-miRNA和premiRNA中，同一个家族的miRNA只有个别碱基的差别，这些对miRNA的检测方法提出了挑战[11]。目前，miRNA的检测方法主要有Northern印迹法、芯片技术和实时荧光定量PCR。

Northern印迹法是检测miRNA表达的传统方法，克隆和生物信息学分析得来的miRNA需经Northern印迹法验证和确认。这种方法灵敏度较低，对样本的需求量较高，要微克级样品才能避免假阴性，且不能进行高通量的检测[12]。

芯片技术是一种高通量研究miRNA表达的方法，可以短时间内同时检测大量miRNA的表达丰度，是目前检测整个基因组内组织特异性miRNA表达丰度最有效的手段。这种方法信息量大却质量低，常伴随假阳性结果，且基于不同技术原理的芯片检测效果不佳，一般用于前期筛选[13]。

实时荧光定量PCR是在反应体系中加入荧光基团，通过荧光信号积累实时检测PCR进程，在扩增的指数期对起始模板进行定量分析。该方法可以灵敏地定量检测低丰度表达的靶分子，并适用于高通量筛选，是目前检测miRNA表达最常用的技术[13-14]。

2 实时荧光定量PCR检测miRNA

实时荧光定量PCR技术能高灵敏地检测低丰度的靶分子，特别是组织标本量有限、基因表达量低以及样品间表达差异很小的情况。但在具体实验中采用不同的检测技术和数据分析方法可能得到不一致的结论。要获得准确、可重复的结果，RNA提取、cDNA合成、引物设计、qPCR扩增产物检测和数据分析这5个方面至关重要[11]。

2.1 RNA提取

从样本中分离出高质量、低分子量的RNA组分是miRNA检测的前提。现行的RNA提取纯化方法主要包括有机溶剂抽提加乙醇沉淀法[15]和硅胶膜离心柱法[16-17]。前者虽能较好地保留小分子RNA，但后续的脱盐和沉淀步骤比较费时费力；后者通常只能富集较大分子的RNA（＞200 nt），小分子RNA往往被漏掉，因而不适用于小分子RNA的分离纯化。目前，商品化的试剂盒如mirVanaTMmiRNA Isolation试剂盒（美国Ambion公司）和miRNeasy Mini试剂盒（美国QIAGEN公司）不仅能有效地将包含miRNA的总RNA从样本中纯化出来，还可以进一步富集小分子RNA（＜200 nt）来提高灵敏度，且兼备离心柱快速离心纯化的优点。要获得可靠的miRNA表达数据，RNA分子完整性指数（RNA integrity number，RIN）一般要大于7[18]。

2.2 cDNA合成

成熟的miRNA片段短、缺乏共同的序列特征，且成熟miRNA的序列也存在于前体中，与mRNA相比，miRNA的逆转录更为复杂。目前，miRNA逆转录的方法主要有两种，一种是通过特异性引物的3′端与目标miRNA结合直接进行逆转录，逆转录引物的5′端结构分茎环[14]和线性[19]两种。茎环逆引物虽然较难设计但可以避免逆转录引物与miRNA的前体或同一家族的miRNA结合。线性逆引物设计简单，但不能阻止引物和前体序列结合，也不能有效区别只有个别碱基差别的同一家族miRNA。另一种方法是使用通用引物逆转录样品中的全部miRNA。通用引物5′端的oligo（dT）序列识别事先经E.coli Poly（A）聚合酶添加至miRNA的3′端，从而将miRNA逆转录成cDNA[20]。使用特异性引物可以降低背景信号，但起始模板量很少以及需要同时检测几个miRNA时，通用引物比较实用。

2.3 引物设计

miRNA的GC含量差异大、互补序列的Tm值不同、同一个家族的miRNA序列相近等特征，给引物设计带来一定难度。qPCR产物的特异性与引物的设计密切相关，引物的设计与逆转录和产物检测方法有关。如果引物和目标序列的预测Tm值较高（＞65℃），可以通过设计较短的引物来增加特异性；如果Tm值较低（＜55℃），往往不能保证引物的特异性。TaqMan®MicroRNA Assay（美国AB公司）是目前检测miRNA的标准技术[14]，其具有在cDNA合成阶段通过茎环逆转录引物和在qPCR阶段通过TaqMan探针双重保障检测的特异性。逆转录引物5′端的茎环结构形成的碱基堆积和空间限制能显著增强逆转录的特异性。TaqMan探针的槽沟结合物结构能在不增加探针长度的情况下提高Tm值，进一步保证特异性。

2.4 qPCR产物检测

qPCR的荧光技术有很多，如SYBR®GreenⅠ核酸染料、TaqMan®探针、分子信标（Molecular beacons）、LUX荧光系统（Light Upon eXtension）和Light-Cycler®HybProbes探针。目前应用于miRNA检测的荧光技术是SYBR®GreenⅠ[20-21]和TaqMan®探针[14，22-23]。SYBR®GreenⅠ是一种与DNA双链结合的荧光染料，其与DNA双链的结合是非特异性的，需进行融解曲线分析来确定产物的特异性，且不能复合检测多个目标分子。TaqMan®探针是双标记的水解探针，是与特异性产物结合的短序列，其5′端标记荧光报告基团，3′端含有淬灭基团，探针完好时淬灭基团吸收报告基团的荧光。当PCR反应进行时，Taq酶水解探针，荧光报告基团发出荧光信号，每合成一个双链就产生一个荧光信号。TaqMan®探针不受miRNA前体、引物二聚体和非特异性扩增产物的干扰，对于家族miRNA的检测特异性高，定量检测的线性范围跨越7个数量级，可以准确定量扩增目标[14]。

2.5 数据分析

比较样本间miRNA的表达丰度需要进行标准化以消除非生物学变化对结果的影响，使用内参基因是标准化的常用方法[24]。传统的内参基因并不适用所有的实验条件，在具体实验中必须验证内参基因的稳定性[24]。Vandesompele等[25]建议使用多个内参基因以提高数据分析的准确性。Mestdagh等[26]报道使用miRNA平均表达值归一法进行miRNA表达数据的标准化，但此方法比较适用于检测分析大量的miRNA。最近，Hruz等[27]开发的RefGenes软件可从miRNA芯片数据中寻找稳定表达的miRNA作为内参基因。

如何正确分析数据是解释qPCR结果生物学意义的关键。最简单的方法是ΔΔCt法[28]，此法仅依赖Ct值，没有考虑扩增效率对结果的影响。研究发现样本间存在不同的总RNA组成、逆转录抑制物和PCR抑制物，扩增效率不可能总为100%，而扩增效率对相对表达的计算影响甚大[29-31]。尽管ΔΔCt法不能准确估计相对cDNA的初始量，但此法非常简单，可以作为初期快速筛选miRNA特异性表达的方法。相对表达率模型考虑了目标基因和内参基因的扩增效率对表达量的影响，分析更为准确[30-31]，当目标和内参基因的扩增效率都为100%时，此模型本质上等同于ΔΔCt法。

准确定量miRNA的表达丰度不仅需要高灵敏度和高特异性的检测方法，而且还需要精确的数据分析模型。Wang等[31]采用茎环逆转录引物和TaqMan®探针技术检测miRNA的表达丰度以及使用效率校正模型计算相对表达率，提出了一个适用法医学检材中miRNA的分析流程。

3 miRNA的法医学应用及前景

法医工作中鉴定生物斑痕的体液来源对案件性质的判定至关重要。基于传统血清学和免疫学的体液鉴定方法灵敏度各异、周期长、需要检材量大、一次只能验证一种体液、不能确认阴道分泌物和月经血，并不适用于法医实际工作中常常遇到的微量检材[32-36]。近年来，检测组织中特异性表达的mRNA被提出代替传统体液鉴定方法，但热度、湿度、紫外线、pH值和RNA水解酶（ribonuclease，RNase）对mRNA（扩增产物长度200~300 nt）的稳定性有很大影响，检出片段大小有时间依赖性，并受基因组DNA的影响，不适合法医工作中面临的降解检材[35-41]。miRNA片段短、不易降解、表达具有组织特异性或丰度差异性和成熟的检测技术使其本质上更适合法医体液（斑）鉴定。2009年，Hanson等[42]使用SYBR®Green qPCR技术从452个人类miRNA中检测出9个具有体液差异性表达的miRNA（表1）；同时检测体液标记miRNA在人类21种组织中的表达水平，确保标记miRNA的体液特异性，从而将miRNA引入到法医学体液鉴定中。2010年，Zubakov等[43]采用寡核苷酸芯片检测718个人类miRNA在法医常见体液中的表达水平，并用TaqMan qPCR技术鉴定出9个体液标记miRNA（表1），但仅能重复出Hanson等[42]报道的血液和精液标记miRNA，该研究的灵敏度达到了0.1 pg总RNA，且实验室环境下保存1年的陈旧体液斑痕对检出也无明显影响。2011年，Courts等[44]利用Geniom®Biochips检测人类血液和唾液中miRNA的表达水平，后续的SYBR®Green-qPCR确认了6个标记miRNA（表1），但并未检测其他法医常见体液。目前报道的体液标记miRNA数量有限，而且采用不同的检测平台和数学分析模型，所报道的结果不一致、重复性差。Wang等[31，45]首先建立了一个适用法医学检材miRNA的分析流程；其后利用qPCR-array筛选、TaqMan qPCR验证、效率校正模型分析鉴定出5个体液标记miRNA（表1），并评估了扩增效率对检测结果的影响和常用内参基因在法医体液（斑）中的稳定性。目前，在人类已发现的2042个成熟体miRNA（http://www.mirbase.org），可进一步寻找更多的体液标记miRNA。对体液标记的miRNA一方面可尝试建立复合检测体系，另一方面可结合DNA和RNA共提取技术以节约样本量，结合STR分型技术共平台同时检测体液（斑）的来源和STR分型。

表1 文献报道体液标记的miRNA

现场生物检材的种属鉴定可将犯罪嫌疑人与犯罪现场联系起来或在涉及动物交通事故、偷猎等案件时发挥作用。Li等[46]检测人类血液标记miR-16在9种动物血中的表达丰度，尝试利用miRNA进行种属鉴定,结果提示,根据miR-16的表达丰度可以将9种动物分为2个亚组。大多数miRNA基因具有保守性，在脊椎动物已发现的miRNA中有近一半具有同源性[47]，将miRNA应用于种属来源鉴定需要深入研究筛选种属特异性miRNA标记和丰度差异性同源miRNA标记。

李文灿等[48]探讨大鼠死后心肌细胞中miR-1-2和18S rRNA的含量变化与PMI的关系，旨在为PMI推断研究提供新的标记物，以克服传统依据尸体现象、胃内容物消化过程、蝇蛆生长规律等方法的局限性。研究发现在机体死后120 h内miR-1-2的含量保持在一个相对稳定的水平，死亡早期时间内可以作为一个稳定的内参指标反映其他生物学标记物的变化水平。在死亡120 h后miR-1-2含量开始下降，提示miRNA可能有时间依赖降解特性，尚需进一步进行人体检材验证和尸体存放环境温度和湿度等因素对miRNA的影响。

Hackl等[49]采用miRNA芯片技术检测人类细胞衰老模型和机体衰老模型中miRNA的表达丰度，发现4种衰老调节的miRNA：miR-17、miR-19b、miR-20a和miR-106a，其中miR-17最为显著，表明miRNA可作为人类细胞衰老的一种新标记。Noren Hooten等[50]发现9个miRNA（miR-103、miR-107、miR-128、miR-130a、miR-155、miR-24、miR-221、miR-496和miR-1538）在外周血单核细胞中的表达丰度随年龄增长而下降，进一步证实miRNA的表达具有随年龄变化的特征。这些研究提示miRNA的表达丰度可能具有年龄特异性，可为个体年龄推断研究提供一种新思路。

综上，借助miRNA的生物学特征和表达特点，其作为一种新的标记有望在法医学体液鉴定、种属鉴定及PMI推断等方面提供一条新途径。

[1]Bartel DP.MicroRNAs：genomics，biogenesis，mechanism，and function[J].Cell，2004，116（2）：281-297.

[2]Rana TM.Illuminating the silence：understanding the structure and function of small RNAs[J].Nat Rev Mol Cell Biol，2007，8（1）：23-36.

[3]Winter J，Jung S，Keller S，et al.Many roads to maturity：microRNA biogenesis pathways and their regulation[J].Nat Cell Biol，2009，11（3）：228-234.

[4]Lewis BP，Burge CB，Bartel DP.Conserved seed pairing，often flanked by adenosines，indicates that thousands of human genes are microRNA targets[J].Cell，2005，120（1）：15-20.

[5]Hwang HW，Mendell JT.MicroRNAs in cell proliferation，cell death，and tumorigenesis[J].Br J Cancer，2006，94（6）：776-780.

[6]Croce CM，Calin GA.miRNAs，cancer，and stem cell division[J].Cell，2005，122（1）：6-7.

[7]Yoo AS，Staahl BT，Chen L，et al.MicroRNA-mediated switching of chromatin-remodelling complexes in neural development[J].Nature，2009，460（7255）：642-646.

[8]Bentwich I，Avniel A，Karov Y，et al.Identification of hundreds of conserved and nonconserved human microRNAs[J].Nat Genet，2005，37（7）：766-770.

[9]Drummond MJ，McCarthy JJ，Sinha M，et al.Aging and microRNA expression in human skeletal muscle：a microarray and bioinformatics analysis[J].Physiol Genomics，2011，43（10）：595-603.

[10]Liang Y，Ridzon D，Wong L，et al.Characterization of microRNA expression profiles in normal human tissues[J].BMC Genomics，2007，8：166.

[11]Benes V，Castoldi M.Expression profiling of microRNA using real-time quantitative PCR，how to use it and what is available[J].Methods，2010，50（4）：244-249.

[12]Válóczi A，Hornyik C，Varga N，et al.Sensitive and specific detection of microRNAs by northern blot analysis using LNA-modified oligonucleotide probes[J].Nucleic Acids Res，2004，32（22）：e175.

[13]Sato F，Tsuchiya S，Terasawa K，et al.Intra-platform repeatability and inter-platform comparability of microRNA microarray technology[J].PLoS One，2009，4（5）：e5540.

[14]Chen C，Ridzon DA，Broomer AJ，et al.Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR[J].Nucleic Acids Res，2005，33（20）：e179.

[15]Chomczynski P，Sacchi N.Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction[J].Anal Biochem，1987，162（1）：156-159.

[16]Masotti A，Caputo V，Da Sacco L，et al.Quantification of small non-coding RNAs allows an accurate comparison of miRNA expression profiles[J].J Biomed Biotechnol，2009，2009：659028.

[17]方福德.microRNA的研究方法与应用[M].北京：中国协和医科大学出版社，2008：78-83.

[18]Ibberson D，Benes V，Muckenthaler MU，et al.RNA degradation compromises the reliability of microRNA expression profiling[J].BMC Biotechnol，2009，9：102.

[19]Raymond CK，Roberts BS，Garrett-Engele P，et al.Simple，quantitative primer-extension PCR assay for direct monitoring of microRNAs and short-interfering RNAs[J].RNA，2005，11（11）：1737-1744.

[20]Shi R，Chiang VL.Facile means for quantifying microRNA expression by real-time PCR[J].Biotechniques，2005，39（4）：519-525.

[21]Varkonyi-Gasic E，Wu R，Wood M，et al.Protocol：a highly sensitive RT-PCR method for detection and quantification of microRNAs[J].Plant Methods，2007，3：12.

[22]Kuimelis RG，Livak KJ，Mullah B，et al.Structural analogues of TaqMan probes for real-time quantitative PCR[J].Nucleic Acids Symp Ser，1997，（37）：255-256.

[23]Kutyavin IV，Afonina IA，Mills A，et al.3′-minor groove binder-DNA probes increase sequence specificity at PCR extension temperatures[J].Nucleic Acids Res，2000，28（2）：655-661.

[24]Huggett J，Dheda K，Bustin S，et al.Real-time RTPCR normalisation；strategies and considerations[J].Genes Immun，2005，6（4）：279-284.

[25]Vandesompele J，De Preter K，Pattyn F，et al.Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes[J].Genome Biol，2002，3（7）：RESEARCH0034.

[26]Mestdagh P，Van Vlierberghe P，De Weer A，et al.A novel and universal method for microRNA RT-qPCR data normalization[J].Genome Biol，2009，10（6）：R64.

[27]Hruz T，Wyss M，Docquier M，et al.RefGenes：identification of reliable and condition specific reference genes for RT-qPCR data normalization[J].BMC Genomics，2011，12：156.

[28]Livak KJ，Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-△△CTMethod[J].Methods，2001，25（4）：402-408.

[29]Karlen Y，McNair A，Perseguers S，et al.Statistical significance of quantitative PCR[J].BMC Bioinformatics，2007，8：131.

[30]Pfaffl MW.A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR[J].Nucleic Acids Res，2001，29（9）：e45.

[31]Wang Z，Luo H，Pan X，et al.A model for data analysis of microRNA expression in forensic body fluid identification[J].Forensic Sci Int Genet，2012，6（3）：419-423.

[32]Khaldi N，Miras A，Botti K，et al.Evaluation of three rapid detection methods for the forensic identification of seminal fluid in rape cases[J].J Forensic Sci，2004，49（4）：749-753.

[33]Tobe SS，Watson N，Daéid NN.Evaluation of six presumptive tests for blood，their specificity，sensitivity，and effect on high molecular-weight DNA[J].J Forensic Sci，2007，52（1）：102-109.

[34]Myers JR，Adkins WK.Comparison of modern techniques for saliva screening[J].J Forensic Sci，2008，53（4）：862-867.

[35]Virkler K，Lednev IK.Analysis of body fluids for forensic purposes：from laboratory testing to non-destructive rapid confirmatory identification at a crime scene[J].Forensic Sci Int，2009，188（1-3）：1-17.

[36]An JH，Shin KJ，Yang WI，et al.Body fluid identification in forensics[J].BMB Rep，2012，45（10）：545-553.

[37]Juusola J，Ballantyne J.Messenger RNA profiling：a prototype method to supplant conventional methods for body fluid identification[J].Forensic Sci Int，2003，135（2）：85-96.

[38]Juusola J，Ballantyne J.Multiplex mRNA profiling for the identification of body fluids[J].Forensic Sci Int，2005，152（1）：1-12.

[39]Juusola J，Ballantyne J.mRNA profiling for body fluid identification by multiplex quantitative RT-PCR[J].J Forensic Sci，2007，52（6）：1252-1262.

[40]Setzer M，Juusola J，Ballantyne J.Recovery and stability of RNA in vaginal swabs and blood，semen，and saliva stains[J].J Forensic Sci，2008，53（2）：296-305.

[41]Zubakov D，Kokshoorn M，Kloosterman A，et al.New markers for old stains：stable mRNA markers for blood and saliva identification from up to 16-yearold stains[J].Int J Legal Med，2009，123（1）：71-74.

[42]Hanson EK，Lubenow H，Ballantyne J.Identification of forensically relevant body fluids using a panel of differentially expressed microRNAs[J].Anal Biochem，2009，387（2）：303-314.

[43]Zubakov D，Boersma AW，Choi Y，et al.MicroRNA markers for forensic body fluid identification obtained from microarray screening and quantitative RTPCR confirmation[J].Int J Legal Med，2010，124（3）：217-226.

[44]Courts C，Madea B.Specific micro-RNA signatures for the detection of saliva and blood in forensic bodyfluid identification[J].J Forensic Sci，2011，56（6）：1464-1470.

[45]Wang Z，Zhang J，Luo H，et al.Screening and confirmation of microRNA markers for forensic body fluid identification[J].Forensic Sci Int Genet，2013，7（1）：116-123.

[46]Li Y，Wang Z，Hou YP.MiR16 as a microRNA marker applied in species identification[J].Forensic Science International：Genetics Supplement Series，2011，3（1）：e313-e314.

[47]Lagos-Quintana M，Rauhut R，Lendeckel W，et al.Identification of novel genes coding for small expressed RNAs[J].Science，2001，294（5543）：853-858.

[48]李文灿，马开军，张萍，等.大鼠心肌组织中microRNA和18S rRNA的降解与死亡时间的相关性[J].法医学杂志，2010，26（6）：413-417.

[49]Hackl M，Brunner S，Fortschegger K，et al.miR-17，miR-19b，miR-20a，and miR-106a are down-regulated in human aging[J].Aging Cell，2010，9（2）：291-296.

[50]Noren Hooten N，Abdelmohsen K，Gorospe M，et al.microRNA expression patterns reveal differential expression of target genes with age[J].PLoS One，2010，5（5）：e10724.