动物内源性多肽CGA-N46对念珠菌细胞增殖的影响

阎晓慧 李瑞芳 张慧茹 尹艳杰 卢研博 卢亚丽

（河南工业大学生物工程学院，郑州 450001）

动物内源性多肽CGA-N46对念珠菌细胞增殖的影响

阎晓慧 李瑞芳 张慧茹 尹艳杰 卢研博 卢亚丽

（河南工业大学生物工程学院，郑州 450001）

CGA-N46是人嗜铬粒蛋白N端具有抗真菌活性的多肽片段。采用MTT法检测CGA-N46对克柔念珠菌生长的抑制作用，以β-1，3-葡聚糖酶活性检测克柔念珠菌细胞壁的完整性，采用PI检测克柔念珠菌细胞膜通透性，用罗丹明123检测线粒体膜电位。试验结果证实，0.5 mg/mL的CGA-N46能够明显抑制克柔念珠菌的细胞增殖能力；对其细胞壁的完整性及细胞膜的通透性没有影响；CGA-N46能明显降低线粒体膜电位。推测CGA-N46可能通过影响线粒体膜电位来抑制克柔念珠菌的生长。

CGA-N46 克柔念珠菌 抑菌作用 线粒体膜电位

动物内源性多肽作为存在于动物机体的非特异性免疫因子，对识别、抵抗和杀灭入侵动物机体的有害微生物，维持动物健康有重要作用。动物内源性多肽在快速杀菌的同时，还具有不易产生耐药性、生物安全性高及中和内毒素等特性，目前已成为世界抗菌领域的研究重点，应用前景广阔［1-3］。

近年来，侵染性真菌感染的发病率及死亡率不断升高。侵染性真菌感染主要由念珠菌引起，其中白色念珠菌感染较为突出，但由于唑类抗真菌药物的使用，使白色念珠菌的感染趋势下降，而对氟康唑天然耐药的克柔念珠菌的感染呈升高趋势［4］。克柔念珠菌的毒力虽稍弱于白色念珠菌，但其凭着强大的黏附力，附着人体表面并繁殖，引起口腔、肺部、阴道及全身多系统感染，从而严重威胁患者生命［5，6］。

嗜铬粒蛋白Chromogranin A（以下简称CGA）普遍存在于动物内分泌细胞和神经细胞中，由439个氨基酸组成，CGA中有保守的蛋白酶切位点，能够被水解为具有不同生物功能的多肽片段［7］。前期研究克隆了CGA N端的不同基因片段，通过测定其抗菌活性，证实位于CGA N端31-76位氨基酸组成的CGA-N46具有较强的抗真菌活性［8］；抗菌谱试验表明CGA-N46可抑制多种致病真菌的增殖并诱导其细胞死亡，特别是对克柔念珠菌抑菌活性最强［9］，但其具体作用机制尚不清楚。

目前研究认为，大部分抗菌肽的抑菌机制是膜结构破坏型，如抗菌肽Protegrin能以多聚体的形式结合在细胞膜上，在细胞膜上形成孔道使细胞内钾离子渗漏导致细胞死亡［10］。少数抗菌肽能在不破坏细胞膜结构的情况下透过膜，与胞内细胞器和大分子相互作用，广泛影响胞内核酸合成与修复、蛋白质合成、细胞壁与隔膜合成等生理活动，从而发挥杀菌抑菌作用。如细菌素Lcn972主要通过与细胞壁前体特异性结合，从而阻碍细胞分裂［11］。本试验通过研究CGA-N46对克柔念珠菌细胞壁、细胞膜及线粒体膜电位的作用，旨在阐明CGA-N46的作用机理，为其作为抗真菌药物研究的靶标提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

克柔念珠菌：郑州大学第一附属医院检验科惠赠。噻唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）、碘化丙啶（PI）、罗丹明123（Rh-123）、昆布多糖均购自美国Sigma公司，Triton X-100购自华美生物工程有限公司，其它化学试剂为分析纯。沙保氏（SDA）液体培养基：葡萄糖40 g，蛋白胨10 g，蒸馏水1 L。

1.2 方法

1.2.1 CGA-N46对克柔念珠菌的抑制率 将克柔念珠菌接种于SDA液体培养基中，30℃培养至对数期。参照文献［12］方法并加以改进。将CGA-N46分别以不同浓度0、0.5、1、2、4、8 mg/mL加入含克柔念珠菌细胞（106个细胞/孔）的96孔板中，每个浓度设4个重复，同时设不含细胞外、其他条件相同的空白对照。孵育3 h后，每孔加入10 μL MTT（5 mg/mL），培养4 h，弃培养液，加入150 μL DMSO，振荡孵育20 min，至颗粒完全溶解，酶标仪上测定570 nm处的吸光度（A），以下列公式计算抑制率。

细胞抑制率（%）=［1-（加药组A值-空白组A值）/（零浓度组A值-空白组A值）］×100% 1.2.2 β-1，3-葡聚糖酶活测定 采用还原法测定β-1，3-葡聚糖酶液与CGA-N46混合物的酶活性。将β-1， 3-葡聚糖酶液与0、1、2、4、8 mg/mL CGA-N46 孵育30 min，加入昆布多糖进行还原反应，设蒸馏水为空白对照，检测550 nm 处的吸光光度值（A）。每个浓度做3个重复，取平均值，记为OD550；与不加CGA-N46反应混合物进行比较，差值记A550 nm。根据葡萄糖标准曲线，将2组OD550差值折算成还原糖量。定义一个酶活单位（U）为每分钟生成相当于1 μg葡萄糖的还原糖所需的酶量。根据酶活单位计算不同浓度CGA-N46对β-1，3-葡聚糖酶活力的影响。

1.2.3 细胞膜通透性测定 取106CFU/mL克柔念珠菌与0、1、2、4、8 mg/mL CGA-N46作用3 h，收集菌体沉淀，20 mmoL/L pH6.0 的磷酸钠缓冲液冲洗菌体沉淀2次，重悬后，加入PI（终浓度为50 μg/mL），室温、避光作用10 min以上，在488 nm激发光下观察荧光强度。以不添加CGA-N46组、加入 PI的同时加入Triton X-100（终浓度为0.3%）作为阳性对照。

1.2.4 线粒体膜电位测定 将克柔念珠菌接种于SDA液体培养基中，30℃培养至对数期，调整菌体终浓度为107CFU/mL，与不同浓度（0、1、2、4、8 mg/mL）CGA-N46作用3 h后，离心，取菌体沉淀，用PBS重悬菌体沉淀为相同浓度的菌悬液。每个样品中加入1 μL Rh-123溶液（终浓度10 μg/mL），避光条件下静置作用30 min，PBS洗涤1次。取20 μL制片，荧光显微镜下，蓝光区进行观察。根据荧光强度判断线粒体膜电位变化情况。

1.2.5 统计学分析 用SPSS18.0 软件进行组间方差分析。

2 结果

2.1 CGA-N46对克柔念珠菌的抑制作用

对数生长期的克柔念珠菌细胞经不同浓度CGAN46处理3 h，MTT检测CGA-N46对克柔念珠菌的抑制作用（表1）。

由表1可知，当CGA-N46浓度为0.5 mg/mL时，细胞抑制率为41.11%；当CGA-N46浓度增至8 mg/mL时，其细胞抑制率就增加至85.00%。由此可见，CGA-N46能使克柔念珠菌细胞的生长明显受到抑制，且对克柔念珠菌细胞抑制率呈现浓度依赖性升高。

2.2 CGA-N46对细胞壁的影响

通过测定β-1，3-葡聚糖酶活性检测细胞壁的完整性。CGA-N46对β-1，3-葡聚糖酶活性的影响如图所示（图1），没有经过CGA-N46处理的β-1，3-葡聚糖酶的活性为21.986。当CGA-N46浓度为1、2、4、8 mg/mL 时，反应混合物中β-1，3-葡聚糖酶的活性没有显著变化，分别为22.114、22.144、22.015和22.085。说明CGA-N46对β-1，3-葡聚糖酶活性没有明显影响，也即细胞壁的完整性不受CGA-N46的影响。

2.3 CGA-N46对克柔念珠菌细胞膜通透性的影响

将不同浓度CGA-N46与克柔念珠菌作用3 h后，PI荧光染色，在荧光显微镜下观察，结果如图2所示。阳性对照Triton X-100处理则出现红色荧光，而经不同浓度CGA-N46处理克柔念珠菌3 h后，克柔念珠菌内没有明显的荧光，说明CGA-N46不能破坏克柔念珠菌细胞膜的通透性。

2.4 CGA-N46对克柔念珠菌细胞内线粒体膜电位的影响

将不同浓度CGA-N46与克柔念珠菌作用3 h后，用Rh-123荧光探针标记CGA-N46处理过的克柔念珠菌细胞，以检测线粒体膜电位的变化。如图3所示，经0、1、2、4、8 mg/mL CGA-N46处理3 h后，对克柔念珠菌进行Rh-123染色发现，随着CGA-N46浓度的逐渐升高，荧光强度高的克柔念珠菌细胞明显减少，说明CGA-N46能明显降低其线粒体膜电位。

3 讨论

MTT常用来检测细胞存活和生长，是线粒体呼吸链氧化还原酶状态的指示剂，活细胞线粒体内激活态的氧化还原酶能使外源性MTT还原为极其难溶的蓝紫色结晶物并沉积于细胞内，但是死细胞无此作用，故吸光度A值可间接反映细胞内酶的活性及活细胞的数量［13］。本试验通过MTT法观察到，不同浓度（0-8 mg/mL）CGA-N46 作用于克柔念珠菌3 h后，对克柔念珠菌细胞抑制率明显升高，且呈一定的浓度依赖性。这说明CGA-N46降低了菌体细胞线粒体氧化还原酶活性，达到抑菌作用，从而导致菌体细胞活性下降。

β-1，3-葡聚糖是多种真菌细胞壁的构成成分，对细胞壁的完整性以及维持细胞渗透压稳定起着重要作用。β-1，3-葡聚糖在真菌的生长发育过程中具有特殊的重要性，可以作为研究细胞壁完整性的评价指标。房舒等［14］在研究蛇床子素结构修饰物JS-B对辣椒疫霉病菌抑菌作用机制中发现，JS-B能显著降低辣椒疫霉菌丝中β-1，3-葡聚糖酶活性，可通过影响β-1，3-葡聚糖酶活性而起到抑制辣椒疫霉病菌生长。经CGA-N46处理后，β-1，3-葡聚糖酶活性没有明显改变，说明CGA-N46 可能不是通过抑制克柔念珠菌β-1，3-葡聚糖酶活性而起到抑菌作用。

电镜观察可以准确地反映细胞的形态但不能精确地反映细胞膜通透性的变化，而紫外分光光度法由于胞内蛋白及核酸泄漏量很低，影响测定结果的准确性，因此，该方法的精确度和灵敏度都不理想［15］。荧光光谱法具有灵敏度高、选择性强、样品用量少、方法简便等优点，通过荧光探针PI检测CGA-N46处理后细胞内荧光强度的变化，可以精确地表达细胞膜通透性的变化。细胞膜受损主要表现为细胞膜通透性增加，而 PI 不能透过完整的细胞膜，当细胞膜受到损伤后才可进入细胞内部与核酸结合发出荧光。Zendo等［16］对乳球菌属抗菌肽nisinA进行研究发现，nisin A的N端和细胞膜上的LipidⅡ形成胶束复合物，C端插入细胞膜中，在细胞膜上产生空洞，改变了细胞膜的通透性，使细胞内离子和ATP外泄后死亡。克柔念珠菌经不同浓度CGAN46处理3 h后仍未发现胞内荧光强度增加或很少被染色，说明CGA-N46不能破坏克柔念珠菌细胞膜的通透性。

线粒体膜电位下降是细胞死亡级联反应中发生较早的事件。一旦线粒体膜电位降低，细胞就会进入不可逆的凋亡过程，启动凋亡［17］。当线粒体膜电位下降，线粒体的形态和功能就发生了改变。线粒体荧光探针Rh-123 能特异性地与活细胞线粒体结合指示细胞生活代谢状态。在各种刺激下，线粒体Rh-123 荧光强度检测，可代表线粒体数量和线粒体功能状态。Rh-123荧光强度下降，说明线粒体内膜两侧电位差下降，不能提供足够的电位梯度使标记物被吸收和保留在线粒体内；电位差越小，线粒体吸收的染料越少，荧光强度就越弱［18］。本试验采用Rh-123与克柔念珠菌细胞内线粒体基质结合，对线粒体进行标记，并采用荧光显微镜系统检测活细胞内的荧光强度，进行定性分析，以此反映菌体细胞内线粒体膜电位的相对变化。试验结果表明，空白对照组克柔念珠菌细胞内Rh-123荧光强度最强，随着CGA-N46浓度的增强，细胞内Rh-123 荧光强度逐渐减弱。提示CGA-N46可能通过降低线粒体膜电位从而抑制克柔念珠菌增殖并诱导其细胞凋亡。这一研究结果和Fatma 等［19］的研究相同，他们发现真菌毒素AME能诱导人和动物细胞线粒体膜电位降低，激活线粒体凋亡通道致使人和动物细胞的存活能力降低，甚至死亡。

4 结论

CGA-N46对克柔念珠菌细胞壁的完整性和细胞膜的通透性没有影响，可能通过降低克柔念珠菌线粒体膜电位抑制细胞的增殖作用。在这一过程中，CGA-N46是否通过降低线粒体膜电位来诱发线粒体途径的细胞凋亡，还需要进一步研究。

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（责任编辑 李楠）

Effect of Animal Endogenous Polypeptide CGA-N46 on Cell Proliferation of Candidas

Yan Xiaohui Li Ruifang Zhang Huiru Yin Yanjie Lu Yanbo Lu Yali
（College of Bioengineering，Henan University of Technology，Zhengzhou 450001）

CGA-N46 is an N terminal derived peptide of human Chromogranin A (CGA) that has anti-fungal activities. The growth inhibition effect onCandida kruseiwas measured with MTT assay. The cell wall integrity ofCandida kruseiwas examined by monitoring β-1,3-glucanase activity. The effect of CGA-N46 on the permeability ofCandida kruseimembrane was examined using Propidium iodide detection. The effect of CGA-N46 on mitochondrial membrane potential was evaluated through Rh-123 assay. The results of showed 0.5 mg/mL CGA-N46 could significantly inhibit the proliferation of theC. kruseicells. CGA-N46 had no obvious effect on the β -1, 3-glucanase activity. There was no significant influence on the permeability ofC. kruseicell membrane; CGA-N46 could significantly decrease the mitochondrial membrane potential. A conclusion can therefore be made that CGA-N46 may inhibit the growth of Candidas by affecting the mitochondrial membrane potential.

CGA-N46Candida kruseiInhibitory effect Mitochondrial membrane potential

2013-09-09

国家自然科学基金项目（31071922）, 河南省重点科技攻关计划项目（112102310325）, 河南工业大学科学研究基金研究生教育创新计划项目（12YJCX51）

阎晓慧，女，硕士研究生，研究方向：微生物与生化药学; E-mail：879153058@qq.com

李瑞芳，女，博士，教授，研究方向：微生物与生化药学; E-mail：lrf@haut.edu.cn