杆状病毒-昆虫细胞表达系统在复合体重组表达应用中的研究进展

万婧相兴伟江玲丽周向阳

（1.舟山出入境检验检疫局，舟山 316000；2.浙江省海洋开发研究院，舟山 316000）

杆状病毒-昆虫细胞表达系统在复合体重组表达应用中的研究进展

万婧1相兴伟2江玲丽1周向阳1

（1.舟山出入境检验检疫局，舟山 316000；2.浙江省海洋开发研究院，舟山 316000）

真核细胞大部分生命活动是通过复合体催化的。因此，系统了解这些复合体的生物学功能，将在健康和疾病方面具有重要意义。由于内源性复合体存在低丰度和异质性特点，因而直接提取复合体存在一定的困难。杆状病毒-昆虫细胞表达系统可成功表达复合体，为研究复合体的结构和功能提供新的手段。综述近年来利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统进行蛋白质复合体结构和功能研究的进展。

杆状病毒-昆虫细胞表达系统 复合体 晶体结构 功能

异源表达系统目前已成为分子生物学实验室的基础研究工具，对蛋白质功能研究具有深远影响。大肠杆菌表达系统是蛋白表达技术中发展最早、应用最广泛的，现已成功开发了许多表达质粒和相应的宿主菌。目前，蛋白质数据库中（http：//www. rcsb.org/）收录的蛋白大多数是由大肠杆菌表达系统表达的。随着复合体结构和功能研究趋势的日益增加，原核表达系统在大分子量蛋白亚基的表达、翻译后修饰，以及多个蛋白亚基同时表达等方面存在缺陷。因此，有必要利用功能更强大的真核表达系统来表达蛋白质复合体，该系统能够满足结构研究所需数量和质量的复合体。

杆状病毒-昆虫细胞表达系统是将外源目的基因插入杆状病毒载体中，转染入昆虫细胞中对单个蛋白或者蛋白复合体进行高量表达的真核表达系统。该系统自问世以来应用广泛，在过去几年中成为了结构生物学研究的主流。进行复合体结构生物学研究需要考虑样品的制备、实验条件的优化、蛋白复合体表达的成本以及所需的时间等。目前通过改造杆状病毒基因组提高蛋白质复合体的表达、开发多基因组装的新质粒、建立细胞培养、病毒传代、病毒感染和重组蛋白生产的标准操作程序，使杆状病毒-昆虫细胞表达系统成为结构生物学研究中易于使用的常规操作工具［1］。MultiBac是一种杆状病毒表达系统，是在Bac-to-Bac的基础上通过改造转移载体和Bacmid，实现真核多蛋白复合体或者单个基因多拷贝在昆虫细胞中表达的有力工具，由2个供体载体pFBDM和pUCDM和改造过的受体Bacmid组成。目前，已利用MultiBac杆状病毒-昆虫细胞表达系统成功表达多种蛋白质复合体并进行相关结构和功能研究。如酿酒酵母转录中介复合体的头部模块、酵母细胞分裂后期启动复合体APC/C和人转录因子TFIID核心支架复合体等。本文将从这几种复合体阐述杆状病毒-昆虫细胞表达系统在结构生物学研究领域中的应用。

1 酿酒酵母转录中介复合体的头部模块

转录中介复合体是由多个在进化过程中高度保守的亚基组成的蛋白复合体。在基因转录过程中，转录中介复合体分别与基因特异的转录因子和RNA聚合酶II相互作用，是真核生物基因转录的中央控制器［2-4］。于酿酒酵母中首次发现转录中介复合体，其由21个亚基构成，分子量超过1 MD［5，6］。研究证明，转录中介复合体个别亚基的突变，可导致神经系统疾病和癌症［7-14］。因此，阐明转录中介复合体的功能是一个重大的生物医学科学研究课题。但由于转录中介复合体的大分子量、高复杂性和低丰度的特点阻碍了其生物化学和结构的研究。

单粒子电子显微镜首次呈现了转录中介复合体的结构，与RNA聚合酶II的结构不同，其是紧凑型的球状结构。酵母中的转录中介复合体由头部、中部和尾部3个模块构成［15，16］。结构学、遗传学和生物化学研究证明每个模块由7-9个单独的亚基构成（图1-a）。转录中介复合体参与细胞内的多种细胞活动，每个模块执行各自相应的功能［17］。例如，头部模块的亚基与RNA聚合酶C端区域相互作用［18，19］，而中部和尾部模块的亚基直接与转录调控因子发生相互作用［4，20-23］。因此，可通过分别研究各个模块的功能，以期进一步阐明整个复合体的结构和功能，这种策略明显降低了研究整个转录中介复合体结构和功能的复杂性。

1.1 在昆虫细胞中生产转录中介复合体的头部模块

转录中介复合体的头部模块由7个亚基构成，分别为Med17、Med6和Med8，Med11、Med22、Med18和Med20，分子量为223 kD。起初采用杆状病毒共同感染的方法，即将7种不同的重组病毒（每种编码一种亚基）共同感染昆虫细胞［24］。然而，这种方法的试验流程和操作步骤是极其漫长的，而且使得7种重组病毒的滴度保持平行是非常困难的。此外，进行X-射线晶体学研究，需要在尽可能短的时间内生产大量的复合体。因此，利用MultiBac杆状病毒-昆虫细胞表达系统，在同一个杆状病毒中同时表达转录中介复合体头部模块的亚基将会从根本上解决上述问题。MultiBac杆状病毒-昆虫细胞表达系统通过串联重组技术极大方便了多个基因盒的快速串联重组拼装［1］。通过串联重组将编码转录中介复合体头部模块亚基的所有基因组合到单个杆状病毒结构中（图1-b）［25，26］，显著降低了试验的复杂性。将多基因结构整合到MultiBac杆状病毒的基因组中，能有效的减少蛋白质的水解并延长宿主细胞的裂解，有助于提高重组蛋白复合体的质量［1］。最后将重组病毒感染昆虫细胞，在细胞中表达转录中介复合体的头部模块（图1-b）。

1.2 重组转录中介复合体头部模块的结构

重组复合体生产的简化推动了头部模块晶体结构的测定，消除MED17 和MED18的柔韧区可获得良好有序的单晶结构，这有利于衍射数据的收集（图1-c）。此外，在重组产生的蛋白样品中加入硒基-L-甲硫氨酸有助于结构的测定。转录中介复合体头部模块晶体结构的测定，揭示了这一具有组件结合稳定性以及转录调节灵活性的重要复合体是如何组建的，为其他转录因子结构的测定提供了一个平台［26］。值得注意的是，头部模块中的5个亚基同时存在于一个紧凑的结构单元，将其命名为颈部区域。该区域通过形成一个新的多螺旋束，使得转录中介复合体具有稳定性和完整性（图1-c）。

2 后期促进复合体（APC/C）

APC/C是遍在蛋白连接酶复合体，由多个亚基构成，通过蛋白酶体依赖式水解细胞周期调节蛋白，调节细胞周期进程［27-29］。APC/C至少由13种不同的蛋白亚基构成，APC激发E2-遍在蛋白复合体同有丝分裂周期蛋白破坏框结合，然后激发遍在蛋白同破坏框C末端的赖氨酸残基结合，此过程不断循环使遍在蛋白多聚化。真核生物中APC/C是高度保守的，由于某些蛋白亚基具有两个拷贝。因此，整个APC/C由18-19个亚基组成，分子量范围在1-1.2 MD之间［30］。

2.1 利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统生产重组APC/C

APC/C大部分亚基分子量较大，遗传操作性难度高，内源性丰度低，这些因素限制了APC/C的结构和生化研究。近年来发展的基于MultiBac杆状病毒-昆虫细胞表达系统，可以重组产生酿酒酵母以及人的APC/C，这极大地推动了APC/C的结构学、生化学和生理学的发展［30，31］。利用MultiBac杆状病毒-昆虫细胞表达系统重组表达了酿酒酵母的APC/C，即通过构建两种分别编码5个亚基和8个亚基的重组病毒进行共表达。利用重组共表达系统生产的完整APC/C的产量是内源性的200多倍，达到0.5 mg/L。通过结构生物学比较分析酿酒酵母的内源性和重组APC/C，发现重组表达的复合体是正确组装的（图2-a 和图2-b）。而且在激活剂存在的条件下，以一种D box和 KEN box依赖的方式实现有丝分裂细胞周期蛋白的泛素化［30］。利用重组的APC/C能够重塑内源性APC/C的催化和调节功能，而且明确了酿酒酵母APC/C的分子组成，对全面系统的了解APC/C具有重要意义。

2.2 解析重组酵母的APC/C

重组表达整个和部分APC/C，得以精确测定APC/C的质量。质朴分析含有8个亚基的APC/C部分复体，测定的分子量为698.8 kD，与所有亚基的化学计量法所得的结果是一致的［30］。根据APC/C的结构图重组产生了APC/C的部分复体，明确了三维APC/C中每个亚基的分子边界。例如，Cdc16-Cdc26的差异密度密切对应Cdc16-Cdc26异源四聚体的晶体结构，通过差异密度可比较两个APC/C部分复合体的差异（图2-c）。通过亚基删除策略，可以系统的调配APC/C的大部分亚基。通过整合APC/C单个亚基同源模型的晶体结构，利用冷冻电子显微镜在10 Å的分辨率下重塑APC/CCdh1.D-box三元复合体［32］，解析了高分辨率的APC/C亚基组成和原子模型［30，32］（图2-d）。亚基删除策略可精确界定APC/C亚基的分子边界，相较于N端和C端标记粗略定位亚基的方法，该策略使得亚基原子模型的对接更准确可靠。

2.3 利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统表达人的整个APC/C

近期，两个研究团队利用昆虫/杆状病毒表达系统表达和重构人的APC/C［31，33］。其中一个研究团队利用MultiBac的pFBDM 和pUCDM载体构建了多基因表达载体［34］，并利用USER连接依赖式的克隆方法［35，36］将所有的14个基因插入两个重组病毒［31］。而另一个研究团队构建了14种重组病毒，每种重组病毒表达单个APC/C亚基，然后将所有的重组病毒共同感染昆虫细胞进行生化研究［33］。通过此种方法，明确Apc15 和Apc16也为人APC/C的组分。在鉴定Apc16之前，尝试构建完整组装的人重组APC/C无法获得成功［31］。这表明Apc16定位于TPR部分复合体中［37］，是人APC/C精确组装所必需的。因此，利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统可重构正确组装的人APC/C，表明APC/C发挥功能所必需的所有亚基都得到了鉴定（图2-e和图2-f）。

2.4 有丝分裂期检验点复合体（MCC）的X-射线结构

染色体分离的过程由一种被称为纺锤体检验点的系统控制，通过MCC抑制APC/C，以确保子细胞获得正确数目的染色体［38］。MCC组分包括：APC/C 共激活剂 Cdc20以及检验点蛋白Mad2、Mad3（BubR1）、Bub3和激酶Bub1，Mph1（Mps1）和 Aurora B。利用MultiBac杆状病毒-昆虫细胞表达系统表达酿酒酵母MCC，其晶体结构表明Cdc20，Mad2 和Mad3组装成为三角形的异源三聚体（图2-g）［39］。Mad3通过与Mad2 和Cdc20形成许多亚基内的相互作用协调整个复合体，其N端区域的螺旋-环-螺旋模体可同时结合Mad2和Cdc20。

3 人通用转录因子TFIID

RNA聚合酶II（Pol II）启动转录需步进式组装的前起始复合体，该复合体由Pol II、TBP及通用转录因子TFIIA、B、D、E、F和H构成［41-43］。其中TFIID是启动子识别复合体，是前体复合体组装的基石，作为共激活剂介导信号的传递。人的TFIID由14个蛋白亚基构成，由TATA-box结合蛋白（TATA-box binding protein，TBP）和TBP协同因子（TBP-associated factors）在体内装配为复合体，分子量约为1.6 MD。TFIID可识别和结合核心启动子，指导其他通用转录因子参与组装［43］。

目前，对TFIID的精细分子模型、在细胞中的组装，与染色质和其他因子互作的机制还了解甚少。研究TFIID在转录中的作用，有助于进一步理解基因表达调控。利用透射电镜解析人类和酵母TFIID的整体形状，都为类似于分子钳的非对称三裂结构［43］。细胞中内源性TFIID的水平非常低且复合体分子量大，阻碍了研究人员在分子细节上破译其结构和功能。

目前，关于TFIID内亚基拷贝数的共识是：TAFs的 子 集（TAF4、TAF5、TAF6、TAF9和TAF12）含有两个拷贝，而TBP和剩余的TAFs含有一个拷贝［41］。由于人类和酵母TFIID复合体的进化保守性以及形状的整体相似性，推测所有物种的该复合体的亚基组成是类似的。研究人员利用RNAi技术敲除体外培养的果蝇组织的TFIID特异亚结构［44］，发现TAF4，TAF5，TAF6，TAF9和TAF12组成一个稳定的TFIID核心支架复合体，对维持复合体稳定性起到关键性作用。TFIID核心支架复合体存在两个对称的拷贝，而剩余的TAFs和TBP作为外围亚基，这暗示了TFIID在组装过程中可能发生了一个对称到非对称的过渡。此外，利用冷冻电子显微镜研究酵母的TFIID，也观察到相对较小的对称结构［45］。这些结果表明，对称TFIID核心支架复合体的存在对整个复合体的完整性和组装是至关重要的。最近，研究人员通过单颗粒冷冻电子显微镜，发现TFIID转录因子有两种不同的结构状态并存（标准态和重排态）。这一结构转换能够起始转录，将DNA的遗传学信息转录到RNA中以便进行蛋白合成，展示了转录因子组合调控基因表达水平从而增加多样性的机制［46］。

利用MultiBac杆状病毒-昆虫细胞表达系统、冷冻电子显微镜、X-射线晶体学和同源模型分析方法，解析人类TFIID核心支架复合体由10个亚基组成，分别为两个拷贝的TAF4、5、6、9和12［48］（图3）。起初，通过单个杆状病毒构建多基因表达盒，表达TFIID核心支架复合体［34］，与酿酒酵母转录中介复合体头部模块的研究方法是相似的［26］。然而，单个亚基的表达水平差异很大，导致整个重组复合体的产量明显降低。相对于含有所有亚基的正常组装的复合体的表达水平，单个亚基的表达水平是很高的。利用亲和标签标记低表达量的亚基，可提高TFIID核心支架复合体的产量。然而，电子显微镜分析发现小标签的存在干扰复合体的结构。

解决这一瓶颈的方法来自于研究如冠状病毒等某些病毒时所采用的策略。当病毒复制时，可以表达长的开放式阅读框而形成多聚蛋白，这些多聚蛋白经过高度特异性蛋白酶的加工成为单个功能性多肽。MultiBac杆状病毒-昆虫细胞表达系统就应用这一策略，将编码烟草蚀纹病毒NIa蛋白酶的基因以及相应的识别和切割序列插入到长的开放式阅读框的5'端［1，49］。为了便于观察和定量多聚蛋白的表达，在ORF的3'端插入编码绿色荧光蛋白的基因（图3-a）。结果表明烟草蚀纹病毒NIa蛋白酶可有效、特异地加工多聚蛋白，而且通过绿色荧光的强度可以定量多聚蛋白的表达水平。通过这一策略获得了极其丰富的、正确装配的TFIID核心支架复合体（包含10个亚基），并利用电子显微镜和X射线晶体学数据进行高分辨率分析（图3-b和图3-c）。TFIID核心支架复合体的结构是对称的，而TAF8和TAF10的结合破坏了TFIID核心支架复合体原有的对称结构，通过吸收剩余的TAFS和TBP，使得整个TFIID复合体的结构是非对称的［48］。

4 结语

研究人员首先利用MultiBac杆状病毒-昆虫细胞表达系统成功表达酿酒酵母转录中介复合体的头部模块，然后利用冷冻电子显微镜和X-射线晶体学成功解析酿酒酵母转录中介复合体头部模块的晶体结构：其由Med17、Med11、Med22、Med6、Med8、Med18和Med20组成，包括固定爪、活动爪和颈部3个区域，其中颈部区域形成一个新的多螺旋束［26］。按照同样的思路，成功解析细胞分裂后期启动复合体APC/C和人转录因子TFIID核心支架复合体的晶体结构。可见，MultiBac杆状病毒-昆虫细胞表达系统已成为复合体结构生物学研究中的强有力工具。

进行蛋白质晶体学研究需要大量高丰度的均一化样品，才能得到高分辨率的晶体结构信息。电子显微镜、单粒子分析和质谱分析不需要高丰度蛋白样品，但对样品的均一化程度要求较高［47］。同样，蛋白的功能研究和药物应用同样需要高度均一化的蛋白样品。细胞大部分生命活动通过蛋白质复合体实现，而对复合体的结构和功能的详尽研究主要依赖于重组表达。然而，内源性复合体存在低丰度和异质性特点，因而直接提取复合体存在一定的困难。利用MultiBac杆状病毒-昆虫细胞表达系统可以明确界定复合体的亚基组成，增加蛋白样品的产量和均一化。此外，加工和突变特定的亚基可明确其在复合体中的功能和精细定位，这对全面了解复合体的生物学功能至关重要。

利用杆状病毒真核表达系统表达真核生物的复合体，能够符合结构晶体学研究所需的质量和数量。近年来，真核表达技术获得了长足发展，为其他关键复合体结构和功能的研究提供了新的思路，也为结构晶体学的进一步发展奠定了基础。

［1］ Bieniossek C, Imasaki T, Takagi Y, et al. MultiBac：expanding the research toolbox for multiprotein complexes［J］. Trends Biochem Sci, 2012, 37：49-57.

［2］ Kornberg RD. Mediator and the mechanism of transcriptional activation［J］. Trends Biochem Sci, 2005, 30：235-239.

［3］ Boube M, Joulia L, Cribbs DL, et al. Evidence for a mediator of RNA polymerase II transcriptional regulation conserved from yeast to man［J］. Cell, 2002, 110：143-151.

［4］ Malik S, Roeder RG. The metazoan Mediator co-activator complex as an integrative hub for transcriptional regulation［J］. Nat Rev Genet, 2010, 11：761-772.

［5］ Bjorklund S, Gustafsson CM. The yeast Mediator complex and its regulation［J］. Trends Biochem Sci, 2005, 30：240-244.

［6］ Guglielmi B, van Berkum NL, Klapholz B, et al. A high resolution protein interaction map of the yeast Mediator complex［J］. Nucleic Acids Res, 2004, 32：5379-5391.

［7］ Firestein R, Bass AJ, Kim SY, et al. CDK8 is a colorectal cancer oncogene that regulates beta-catenin activity［J］. Nature, 2008, 455：547-551.

［8］ Rump P, Niessen RC, Verbruggen KT, et al. A novel mutation in MED12 causes FG syndrome（Opitz-Kaveggia syndrome）［J］. Clin Genet, 2011, 79：183-188.

［9］ Graham JM Jr, Visootsak J, Dykens E, et al. Behavior of 10 patients with FG syndrome（Opitz-Kaveggia syndrome）and the p.R961W mutation in the MED12 gene［J］. Am J Med Genet A, 2008, 146A：3011-3007.

［10］ Makinen N, Mehine M, Tolvanen J, et al. MED12, the mediator complex subunit 12 gene, is mutated at high frequency in uterine leiomyomas［J］. Science, 2011, 334：252-255.

［11］ Berti L, Mittler G, Przemeck GK, et al. Isolation and characterization of a novel gene from the DiGeorge chromosomal region that encodes for a mediator subunit［J］. Genomics, 2001, 74：320-332.

［12］ Kaufmann R, Straussberg R, Mandel H, et al. Infantile cerebral and cerebellar atrophy is associated with a mutation in the MED17 subunit of the transcription preinitiation mediator complex［J］. Am J Hum Genet, 2010, 87：667-670.

［13］ Hashimoto S, Boissel S, Zarhrate M, et al. MED23 mutation links intellectual disability to dysregulation of immediate early gene expression［J］. Science, 2011, 333：1161-1163.

［14］ Rieker RJ, Agaimy A, Moskalev EA, et al. Mutation status of the mediator complex subunit 12（MED12）in uterine leiomyomas and concurrent/metachronous multifocal peritoneal smooth muscle nodules（leiomyomatosis peritonealis disseminata）［J］. Pathology, 2013, 45：388-392.

［15］ Cai G, Imasaki T, Takagi Y, et al. Mediator structural conservation and implications for the regulation mechanism［J］. Structure, 2009, 17：559-567.

［16］ Davis JA, Takagi Y, Kornberg RD, et al. Structure of the yeast RNA polymerase II holoenzyme：Mediator conformation and polymerase interaction［J］. Mol Cell, 2002, 10：409-515.

［17］ Conaway RC, Conaway JW. Origins and activity of the mediator complex［J］. Semin Cell Dev Biol, 2011, 22：729-734.

［18］ Thompson CM, Koleske AJ, Chao DM, et al. A multisubunit complex associated with the RNA polymerase II CTD and TATA-binding protein in yeast［J］. Cell, 1993, 73：1361-1375.

［19］ Hengartner CJ, Thompson CM, Zhang J, et al. Association of an activator with an RNA polymerase II holoenzyme［J］. Genes Dev, 1995, 9：897-910.

［20］ Lee YC, Park JM, Min S, et al. An activator binding module of yeast RNA polymerase II holoenzyme［J］. Mol Cell Biol, 1999, 19：2967-2976.

［21］ Taatjes DJ. The human Mediator complex：a versatile, genomewide regulator of transcription［J］. Trends Biochem Sci, 2010, 35：315-22.

［22］ Balamotis MA, Pennella MA, Stevens JL, et al. Complexity in transcription control at the activation domain-mediator interface［J］. Sci Signal, 2009, 2：ra20.

［23］ Koh SS, Ansari AZ, Ptashne M, et al. An activator target in the RNA polymerase II holoenzyme［J］. Mol Cell, 1998, 1：895-904.

［24］ Takagi Y, Calero G, Komori H, et al. Head module control of mediator interactions［J］. Mol Cell, 2006, 23：355-364.

［25］ Cai G, Imasaki T, Yamada K, et al. Mediator head module structure and functional interactions［J］. Nat Struct Mol Biol, 2010, 17：273-279.

［26］ Imasaki T, Calero G, Cai G, et al. Architecture of the Mediator head module［J］. Nature, 2011, 475：240-243.

［27］ Pines J. Cubism and the cell cycle：the many faces of the APC/ C［J］. Nat Rev Mol Cell Biol, 2011, 12：427-438.

［28］ Sullivan M, Morgan DO. Finishing mitosis, one step at a time［J］. Nat Rev Mol Cell Biol, 2007, 8：894-903.

［29］ Barford D. Structural insights into anaphase-promoting complex function and mechanism［J］. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 2011, 366：3605-3624.

［30］ Schreiber A, Stengel F, Zhang Z, et al. Structural basis for the subunit assembly of the anaphase-promoting complex［J］. Nature, 2011, 470：227-232.

［31］ Zhang Z, Yang J, Kong EH, et al. Recombinant expression, reconstitution and structure of human anaphase-promoting complex（APC/C）［J］. Biochem J, 2013, 449：365-371.

［32］ da Fonseca PC, Kong EH, Zhang Z, et al. Structures of APC/C（Cdh1）with substrates identify Cdh1 and Apc10 as the D-box coreceptor［J］. Nature, 2011, 470：274-278.

［33］ Uzunova K, Dye BT, Schutz H, et al. APC15 mediates CDC20 autoubiquitylation by APC/C（MCC）and disassembly of the mitotic checkpoint complex［J］. Nat Struct Mol Biol, 2012, 19：1116-123.

［34］ Berger I, Fitzgerald DJ, Richmond TJ. Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes［J］. Nat Biotechnol, 2004, 22：1583-1587.

［35］ Bitinaite J, Rubino M, Varma KH, et al. USER friendly DNA engineering and cloning method by uracil excision［J］. Nucleic Acids Res, 2007, 35：1992-2002.

［36］ Geu-Flores F, Nour-Eldin HH, Nielsen MT, et al. USER fusion：a rapid and efficient method for simultaneous fusion and cloning of multiple PCR products［J］. Nucleic Acids Res, 2007, 35：e55.

［37］ Hutchins JR, Toyoda Y, Hegemann B, et al. Systematic analysis of human protein complexes identifies chromosome segregation proteins［J］. Science, 2010, 328：593-599.

［38］ Musacchio A, Salmon ED. The spindle-assembly checkpoint in space and time［J］. Nat Rev Mol Cell Biol, 2007, 8：379-393.

［39］ Chao WC, Kulkarni K, Zhang Z, et al. Structure of the mitotic checkpoint complex［J］. Nature, 2012, 484：208-213.

［40］ Herzog F, Primorac I, Dube P, et al. Structure of the anaphasepromoting complex/cyclosome interacting with a mitotic checkpoint complex［J］. Science, 2009, 323：1477-1481.

［41］ Cler E, Papai G, Schultz P, et al. Recent advances in understanding the structure and function of general transcription factor TFIID［J］. Cell Mol Life Sci, 2009, 66：2123-34.

［42］ Muller F, Zaucker A, Tora L. Developmental regulation of transcription initiation：more than just changing the actors［J］. Curr Opin Genet Dev, 2010, 20：533-40.

［43］ Papai G, Weil PA, Schultz P. New insights into the function of transcription factor TFIID from recent structural studies［J］. Curr Opin Genet Dev, 2011, 21：219-224.

［44］ Wright KJ, Marr MT 2nd, Tjian R. TAF4 nucleates a core subcomplex of TFIID and mediates activated transcription from a TATA-less promoter［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2006, 103：12347-12352.

［45］ Papai G, Tripathi MK, Ruhlmann C, et al. Mapping the initiator binding Taf2 subunit in the structure of hydrated yeast TFIID［J］. Structure, 2009, 17：363-373.

［46］ Cianfrocco MA, Kassavetis GA, Grob P, et al. Human TFIID binds to core promoter DNA in a reorganized structural state［J］. Cell, 2013, 152：120-131.

［47］ Sharon M, Robinson CV. The role of mass spectrometry in structure elucidation of dynamic protein complexes［J］. Annu Rev Biochem, 2007, 76：167-193.

［48］ Bieniossek C, Papai G, Schaffitzel C, et al. The architecture of human general transcription factor TFIID core complex［J］. Nature, 2013, 493：699-702.

［49］ Vijayachandran LS, Viola C, Garzoni F, et al. Robots, pipelines, polyproteins：enabling multiprotein expression in prokaryotic and eukaryotic cells［J］. J Struct Biol, 2011, 175：198-208.

（责任编辑 狄艳红）

Advances on the Baculovirus Expression Vector System for Protein Complex Production

Wan Jing1Xiang Xingwei2Jiang Lingli1Zhou Xiangyang1
（1. Zhoushan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Zhoushan 316000；2. Zhejiang Marine Development Research Institute，Zhoushan 316000）

Most essential functions of eukaryotic cells are catalyzed by complex built of many subunits. To well understand their biological function in the process of health and disease, it is imperative to study these complexes. The low abundance and heterogeneity of many essential complexes have limited their extraction from native source material. The baculovirus expression vector system（BEVS）, specifically tailored for multiprotein complex production, has been proven itself to be uniquely suited for overcoming this impeding bottleneck. Here we highlight recent major achievements in multiprotein complex structure research which were catalyzed by this versatile recombinant complex expression tool.

Baculovirus expression vector system Complex Crystal structure Function

2013-8-18

浙江省重大科技专项（2011C13027-1）

万婧，女，硕士研究生，研究方向：微生物与食品安全；E-mail：wanjing9687@126.com

周向阳，男，高级工程师，研究方向：微生物与食品安全；E-mail：zxy@zs.ziq.gov.cn