小鼠诺瓦克病毒研究现状

刘 芹, 魏晓锋, 高 诚2,

(1. 复旦大学, 上海 200032; 2. 上海市计划生育科学研究所, 上海 200032;3. 上海实验动物研究中心, 上海 201203)

小鼠诺瓦克病毒研究现状

刘 芹1,2, 魏晓锋3, 高 诚2,3

(1. 复旦大学, 上海 200032; 2. 上海市计划生育科学研究所, 上海 200032;3. 上海实验动物研究中心, 上海 201203)

诺瓦克病毒(Norwalk virus, NV), 也称为诺如病毒(norovirus, NV)，是引起人类非细菌性胃肠炎的主要病原体，此外，在牛、猪和小鼠也发现了诺瓦克病毒的存在。该病毒可分5个基因型(GI～V)，鼠诺瓦克病毒(Murine norovirus, MNV)属于GV，是一种新发现的感染实验小鼠的病毒，并且被认为是目前小鼠中最流行的一种病毒。MNV是诺瓦克病毒中在细胞内有效复制的病毒，被作为研究诺瓦克病毒复制分子机制的模型，同时 MNV与人诺瓦克病毒(Human noroviruses,HuNV)有许多相似的分子生物学特点，也被认为是研究人诺瓦克病毒的理想病毒模型。

小鼠诺瓦克病毒(MNV); 生物学特点; 流行病学

2003年，Karst等[1]在信号转导蛋白和转录激活因子(STAT1)以及重组体激活基因2(RAG2)缺陷(RAG/STAT1-/-)小鼠中，首次发现并分离到小鼠诺瓦克病毒(Murine Norovirus, MNV)，并将其命名为小鼠诺瓦克病毒-1(Murine Norovirus-1, MNV-1)，MNV-1可以导致RAG/STAT1-/-小鼠发生致死性感染, 病变主要有脑炎、脑膜炎、脑脉管炎、肝炎和肺炎，MNV-1在干扰素αβ和干扰素γ受体阴性(IFNαβγR-/-)的小鼠内较野生型小鼠内毒力更强。自从MNV-1发现以来, 全世界范围SPF级小鼠内又分离出至少29个全序列MNV株, 这些病毒株有87%以上的遗传同一性, 组成一个单一的基因群[2]。

1 MNV的生物学特性

MNV与其他诺瓦克病毒及杯状病毒有许多生物学和分子学的相似性，属于杯状病毒科，无包膜，是线性、正义、单链RNA病毒[3]。基因组RNA长约7.4 kb，3’端有一个多聚A尾结构，5’端共价连接病毒蛋白VPg[4]。诺瓦克病毒RNA基因组由三个主要的开放阅读框架(open reading frames,ORF)组成，ORF1编码一个多聚蛋白，分为几个非结构蛋白; ORF2编码病毒衣壳蛋白(VP1); ORF3编码一个小的结构蛋白(VP2)[5], 此外在MNV基因组，还发现了ORF4，在ORF2重叠区[6]。

MNV是第一个报道能在细胞复制的诺瓦克病毒, 它可以在原代巨噬细胞和树突状细胞内生长, 也可以在传代细胞小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞内生长并产生细胞病变效应(cytopathic effects, CPE)[7]。MNV-1感染RAW264.7细胞18 h后出现CPE，3 d后出现100%的CPE[8]，细胞病变表现为细胞边缘不整齐，部分核固缩，接触抑制障碍，聚集生长，细胞死亡等[8～9]。

MNV属于肠道病原体，随粪便脱落，主要通过粪口途径传播，也可以通过呼吸道传播[10]。通过检测和淘汰(test-and-removal)方法在受污染的设施内很难根除MNV[11]，有研究表明，经口接种MNV的小鼠通过粪便可以持续向体外排毒，8周后仍可在粪便和组织中检测到病毒核酸，有很强的持续感染性[12～13]。口服接种60 d后在小鼠卵巢和子宫内未检测到MNV, 说明胚胎移植方法可以有效地清除病毒, 可以通过剖宫产来尝试净化MNV的感染[14]。

不同MNV病毒株感染小鼠的表现有差异性, 既可以有清除动力学的差异，也可以引起不同的细胞病变效应(CPE), 在野生型小鼠和STAT1-/-小鼠内,MNV-1较MNV-3毒性更强，重要的是，MNV-3感染STAT1-/-小鼠症状与人诺瓦克病毒感染健康成年人的症状更相似棗体重下降，胃腹胀，腹泻，可持续3 d[2]。

细胞转录因子STAT1和IFN受体对于体内抗MNV-1感染非常关键[1]，并且体外生长的MNV-1可以被IFN徕R和STAT1抑制[7]。60%～90%的乙醇可以对MNV起到良好的消毒效果[15]，所以使用含酒精成分的洗手液等清洁产品可能有助于预防人诺瓦克病毒的感染。温度高于60℃时，可以观察到MNV和病毒样颗粒发生结构改变，这些改变可以影响病毒毒力，经60～70 ℃处理的MNV，其感染性明显下降，80 ℃和100 ℃处理后，噬斑试验无噬斑形成[16],表明高于60 ℃时MNV可以失活，有助于预防其感染，并且可以作为处理食物污染MNV的依据。

2 MNV的检测方法

MNV的检测方法包括血清学方法、分子学检测法以及噬斑试验。

2.1 血清学方法

血清学方法是实验小鼠病毒检测最常用的方法，其中ELISA方法经济、快速、灵敏度好，并且特异性强，所以应用广泛，所用样本为血清，可以动态观察病毒感染情况。

MNV感染的诊断主要通过血清学方法，吸附ELISA实验中，通过连续稀释MNV,可检出MNV的最低病毒量约为100个感染性病毒颗粒[16]。Hsu等[12]建立了一种高通量的新型血清学检测方法棗流式荧光微球检测技术，检测小鼠内的MNV抗体,检测发现小鼠饲养设施中自然感染MNV非常普遍，与传统的ELISA方法相比，具有高通量、灵敏度高，特异性强的优点，例如，每反应孔中仅需0.2 μl血清样本就可同时检测100种分析物，此方法有利于样本量较少的实验检测。

新感染或免疫缺陷小鼠因为不产生免疫球蛋白，所以这种情况下血清学方法使用受限，需要采用分子学方法。

2.2 分子检测法

RT-PCR可以直接检测多种样本，如粪便、组织、器官等。分子检测方法，包括RT-PCR和实时RT-PCR都非常灵敏，但是不能区分感染性和非感染性病毒颗粒[17]。RT-qPCR现在被广泛作为病毒RNA定量的方法。许多MNV的RT-qPCR实验已经被改进，可以估计感染组织、细胞或者粪便样本中的病毒载量[1,18～20]。

日本实验动物中央研究所曾将实验感染的SCID小鼠和ICR小鼠分别与未感染的同品系小鼠混养, 收集同居0 d、2 d、4 d、7 d、14 d和21 d的粪便, 利用PCR扩增粪便中的病毒核酸，结果表明，同居2 d后，1/3 SCID小鼠和3/4 ICR小鼠检出NV, 同居4～21 d，所有小鼠均检出NV[21]。

Hsu等[12]通过灌胃法对10只小鼠接种MNV-1病毒液，收集0～7 d的小鼠粪便，利用RT-PCR方法检测粪便中MNV-1病毒核酸，发现0 d时无阳性结果，1 d时10只小鼠全部为阳性，2～7 d呈依次递减趋势，7 d时仅两只小鼠为阳性。接种后第5周将小鼠实施安死术后进行解剖，粪便样本无阳性结果，肠系膜淋巴结、脾、空肠组织中分别有3只、1只、1只检测到MNV-1，实验中设置对照组未感染MNV-1，结果均为阴性。

2.3 噬斑试验

利用MNV在细胞内增殖特点，可以通过噬斑试验来量化样本中的感染颗粒，原理是MNV-1可以溶解细胞，在融合的单层细胞上形成噬斑。在普通噬斑试验的基础上改进的荧光灶试验(Fluorescent focus assay，FFA)可以更加快速、准确的检测病毒, 但是使用的试剂及设备要求更高, 例如抗体, 计数集落形成单位的显微镜等。噬斑试验还可以纯化分离MNV，但并不是每个MNV病毒株都会形成噬斑，所以并不适用于所有的MNV[22]。

每种检测方法都有其优势和不足，可以根据样本性质，采集样本数，样本量的多少，以及不同病毒株的特性，选择不同的检测方法，提高检出率及检测效率。

3 MNV的流行病学情况

MNV被认为是目前已知实验小鼠病毒中最流行的病毒，其在小鼠中的感染率是排在第二位的细小病毒的10倍[23]。

2005年，密苏里大学的诊断实验室从美国和加拿大的研究机构送检的实验小鼠(n=12 639)血清样本中，利用荧光微球免疫法MFI(Multiplexed fluorescent immunoassay)测得血清抗MNV-1抗体阳性率为22.1%[12]。德国柏林的一项研究，收集来自于两个独立研究设施的76只小鼠，包括28个小鼠品系，经检测，有18(64.3%)个品系的43只(56.58%)小鼠出现MNV阳性[24]。用血清学方法检测MNV，在北美和欧洲的感染率分别为32.64%和24.03%，总感染率为32.37%(n=44 876)[25]。Kim等[26]对韩国5个动物实验室的包括30个小鼠品系的115个小鼠样本进行检测, 约23%的检测样本呈MNV阳性, 这是亚洲第一篇关于MNV的报道。Goto等[14]利用MNV的RNA聚合酶基因序列进行PCR检测，约25%的小鼠饲养设施中发现MNV感染，感染率为13.1%(n=245)，但是盲肠样本中MNV阳性的小鼠，无一例出现临床症状。

袁文等[27]于2010年对广东省内7个小鼠繁育设施进行了感染情况的调查, 其中4个设施小鼠未发生MNV感染，另外3个设施小鼠感染率很高, 206份小鼠盲肠内容物样本中有77 份为阳性，阳性率为37.38%, 且各品系小鼠之间的感染率无显著差异，这是国内首次有关实验小鼠携带MNV的报道。

Ohsugi 等[28]利用血清学和分子方法检测来自日本和美国的普通和SPF级基因修饰小鼠以及日本3个动物繁殖设施的商品化小鼠, 日本普通小鼠MNV抗体阳性率为67.3%，SPF级小鼠为39.1%，美国普通小鼠为62.5%，三个动物繁殖设施中有一个的商品化SPF C57BL/6小鼠阳性率为20%。

由以上数据可见，MNV在实验小鼠的感染很普遍，阳性率可因检测方法或不同地区而有差异，但总体阳性率较高。

4 MNV研究的意义

实验动物质量检测是保证实验动物质量的重要条件，同时也与人们的健康和日常生活息息相关。通过开展MNV的相关研究并建立与之相对的检测方法，了解其感染状况，可以为实验动物的质量控制打下坚实基础。同时建立的检测方法可在实验动物生产单位和使用单位中推广应用，为进一步补充完善实验动物质量控制体系提供技术支持，促进实验动物事业的健康发展。

人诺瓦克病毒是导致急性胃肠炎爆发的重要病原体之一。在全球感染人的非细菌性胃肠炎疾病的病例中超过90%是由该病毒引起的。利用MNV能在细胞内增殖的特性，建立HuNV研究模型，可以进一步了解HuNV的特点，为其检测、预防、治疗提供参考。

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Situation on Research of Murine Norovirus

LIU Qin1,2, WEI Xiao-feng3, GAO Cheng2,3
(1. Fudan University, Shanghai 200032, China;2. Shanghai Institute of Planned Parenthood esearch, Shanghai 200032, China;3. Shanghai Laboratory Animal Research Center, Shanghai 201203, China)

Norwalk virus, also known as norovirus, is the major pathogen to cause human nonbacterial gastroenteritis, in addition, Norwalk virus is also found in cattle, pigs and mice . Norwalk virus can be divided into five genotypes (GI-V), and the murine norovirus (MNV) belongs to GV. MNV is a newly discovered virus infection in laboratory mice, and is considered to be the most popular form of mouse virus. Now, MNV is the only one that can be replicated efficiently in cells of the Norwalk virus, so MNV is regarded as a research model for the molecular mechanism of Norwalk virus. Moreover, MNV and human Norovirus (HuNV) have many similar characteristics of molecular biology, and also is considered to be the ideal virus model for study of human norovirus.

Murine norovirus(MNV); Biological characteristics; Epidemiology

Q95-33

A

1674-5817(2014)02-0167-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2014.02.019

2013-10-18

上海市科委创新行动计划“小鼠诺瓦克病毒的特性研究”(NO.12140900502)

刘 芹(1987-), 女, 硕士, 研究方向: 实验动物质量控制。E-mail: liuqin870101@126.com

魏晓锋, 男, 副研究员, 研究方向: 实验动物质量控制。E-mail: wei.xf@outlook.com