环介导等温扩增技术及其应用

赵丽娟, 周 洁, 高 诚

(1. 扬州大学兽医学院, 扬州 225009; 2.上海实验动物研究中心, 上海 201203)

·综 述·

环介导等温扩增技术及其应用

赵丽娟1,2, 周 洁2, 高 诚2

(1. 扬州大学兽医学院, 扬州 225009; 2.上海实验动物研究中心, 上海 201203)

环介导等温扩增法(LAMP)是一种新的核酸扩增法。该方法在一定温度下一步即可完成扩增反应。由于其扩增效率极高、反应简单快速、高特异性和反应结果只需肉眼观察的特点，LAMP法已广泛应用于病毒、细菌等的定性定量检测和临床疾病的诊断。本文介绍了LAMP方法的原理及其在微生物分子检测方面的应用。

环介导等温扩增法(LAMP); 核酸扩增; 基因检测

2000年日本学者Notomi等[1]发明一种新型的环介导恒温扩增法(即LAMP 法)。LAMP方法针对靶基因的6个区域设计4种特异引物, 利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件(63℃左右)保温30～60 min,即可完成核酸的扩增反应。扩增效率极高，可在15～60 min内实现109～1010倍的扩增。与常规PCR相比，环介导等温扩增法是一种不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程，且简单、快速、特异性强的全新的核酸扩增方法[2]。

1 LAMP技术的原理

LAMP技术针对靶基因设定的6个不同的区域设计了4种特异引物，包括一对内引物(FIP和BIP)和一对外引物(F3和B3)。FIP(forward inner primer)3′端含有与F2c互补的F2区段，在5′端含有与F1c相同序列的区段; BIP(backward inner primer)3′端含有与B2c互补的B2区段，在5′端含有与B1c相同序列的区段; F3(forward outer primer)含有与目标DNA上的F3序列相同的区段; B3(backward outer primer)含有与目标DNA上的B3序列相同的区段。其扩增原理是根据这4条特殊引物，配合Bst DNA聚合酶的作用，在等温条件(63℃左右)DNA开始合成。利用可以产生环状结构的引物和Bst DNA聚合酶的链置换合成活性，靶序列两端引物结合处循环不断地产生环状单链结构。当一个引物向双链DNA 的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链解离变成单链，引物在恒温条件下不断引发新链的合成，靶基因因此得到高效扩增。反应可分为扩增循环起始结构形成阶段和扩增循环阶段[3]。

为使反应时间进一步缩短, 可在体系中加入环引物(Loop Primer F/B)。LAMP环引物是指在哑铃状结构的5′末端的环状单链部分(B1区段与B2区段之间, 或者F1区段与F2区段之间)导入具有互补序列的环引物(分别为环引物B和F), 就能增加DNA合成的起点。环引物的加入，使含环状结构的单链都能用作扩增起点，称为LAMP快速法。与传统LAMP方法相比，LAMP快速法的扩增时间更短。

2 LAMP技术的特点

LAMP技术相比其他技术有很多特点。4个引物对靶序列的6个特异序列区的识别，保证了LAMP扩增的高度特等温高效。LAMP在等温条件下扩增，条件单一，受非靶序列的影响小，并且其检测极限很小，仅为几个拷贝。确定了最适反应温度后，由于无需预先热变性的优势，LAMP反应在1小时内就可将靶序列扩增至109倍[4]。仪器要求宽松，不需要PCR仪和其他检测仪器，仅水浴锅或其他恒温仪器即能完成反应。产物易检测，只需肉眼观察或浊度仪检测沉淀浊度即能判断扩增与否。操作简单，反应不需要特殊试剂，比传统PCR简单，反应后无需电泳，操作人员无需额外培训。LAMP技术也存在缺陷。LAMP的扩增是利用Best DNA聚合酶的链置换反应，因为对靶序列长度有一定的要求，最适长度在300～500 bp内，无法进行长链DNA 的扩增。由于反应灵敏度高，扩增产物数量大, LAMP反应很易造成气溶胶污染。

3 LAMP技术的应用

由于LAMP相比普通核酸扩增方法无法比拟的优点，已经得到越来越多国内外实验人员的青睐。不仅如此，LAMP技术近年来已被多国广泛应用于病原体快速检测，其试剂盒的研发也开始变成新的趋势。近年来LAMP技术又有新的发展和改进，最新报道称聚乙二醇可加速LAMP反应[5]，而其在微生物分子检测方面的报道也不断出现。本文重点列举总结了一些国内外成就以及一些最新进展。

3.1 LAMP在病毒检测中的应用

Imai等[6]用RT-LAMP建立了一个实验室快速检测H5N1禽流感病毒的方法，实验对人类和野生鸟类咽拭子进行监测，结果表明RT-LAMP对H5亚型有更高的特异性，LAMP可作为一个监测禽流感爆发的诊断工具。Duc等[7]设计了一套用RT-LAMP方法特异性扩增H5N1禽流感病毒HA基因新的引物, 对比之前报道过的设计，RT-LAMP法有更好的敏感性和特异性。Zhang等[8]报道了一项人类禽流感病毒HA基因和NA基因的RT-LAMP检测方法。根据与WHO推荐的RT-PCR方法相比, RT-LAMP法更快速。其H7基因的检测极限与RT-PCR相近，但其N9基因的检测敏感性比RT-PCR高出102倍。陈蕾等[9]建立了猪瘟病毒RT-LAMP检测法，灵敏度试验显示RT-LAMP的灵敏度比RT-PCR高102倍，并进行特异性试验结果结果均为阴性证明了RT-LAMP对猪瘟病毒的高度特异性。Yin等[10]针对猪瘟病毒E2基因设计引物进行RT-LAMP试验。结果表明RT-LAMP的阳性预测值和阴性预测值分别为均优于常规RT-PCR，特异性实验结果显示其不对其他猪病毒发生扩增，特异性很高。Miren等[11]用RT-LAMP试剂盒法高效的检测出诺瓦克病毒GI型和GII型, 对比证实了其高度的敏感性。Li等[12]证实用RT-LAMP方法检测技术能基本克服目前在丙型肝炎病毒基因诊断方面存在的一些弊端，且与RT-PCR相比在可操作性和检测时间及设备要求方面拥有更大的优势。Li等[13]用LAMP方法对淋巴囊肿病毒进行快速检测证实了其检出极限与RT-PCR类似，比普通PCR高出10倍，并认为其或能进行淋巴囊肿病毒潜在感染的检测。黄鹤等[14]建立了羊痘病毒CaPV-LAMP的仪器和目测两种方法，其检测方法的最低检测值为比OIE推荐的PCR方法高104倍，为羊痘病毒的实验室检测提供了新的技术手段。Qiao等[15]成功建立了赤羽病毒的RT-LAMP检测法。实验根据赤羽病毒核蛋白上的高保守片段设计引物，结果显示LAMP具有很高的特异性和敏感性，检测极限为5.0 TCID50/ml。Shen等[16]应用RT-LAMP技术检测了番木瓜畸型花叶病毒，根据病毒CP保守序列设计引物，结果证实其敏感性比RT-PCR高出10倍。LAMP方法打破了此前没有可用快速检测番木瓜畸型花叶病毒方法的问题。Dukes等[17]根据3D蛋白聚合酶区设计引物建立的了口蹄疫病毒的LAMP检测法，并与RT-PCR作比较。敏感性实验结果表明用LAMP方法10个拷贝22min即可检出，速度与灵敏度均高于RT-PCR，特异性实验证实该方法有很高的特异性，鉴于其快速高效，LAMP方法可用于野外病原的快速检测。

3.2 LAMP在细菌检测中的应用

Maruyama等[18]率先将LAMP方法与原位杂交技术结合来检测携带stx2基因的大肠埃希菌0157:H7，并应用荧光抗体同步细胞鉴定。吕恒等[19]建立的基于颜色判定的大肠埃希菌O157:H7 LAMP检测方法特异而灵敏，适用于大肠埃希菌O157:H7的快速检测。朱杰仪等[20]建立了副猪嗜血杆菌LAMP方法。试验结果证实了LAMP方法在恒温条件下的高特异性，扩增反应在1h内完成，灵敏度试验证实其比PCR方法敏感102倍。Mitarai等[21]证实了LAMP方法用临床样本检测肺结核的可行性，直接从痰液中检测得结核分枝杆菌的灵敏度很高。方法简单、快速，易操作，可作为一个检测肺结核的主要方法，也能对其他检测方法做出补足。Goto等[22]建立了金黄色葡萄球菌肠毒素4种基因型的LAMP实验，结果表明与传统PCR相比有相等的特异性和较高的灵敏度。证实LAMP技术是一种可应用于临床诊断来筛查和分型金黄色葡萄球菌肠毒素的方法。Han等[23]针对弧菌溶血素基因(vvhA)设计引物进行LAMP扩增和特异性和敏感性实验。结果表明无假阳性或假阴性，特异性很高且比常规的PCR敏感10倍。Wei等[24]针对鼠疫耶尔森氏菌特有F1基因设计一套LAMP引物，为鼠疫炎耶尔森菌的检测提供了新的发展方向，认为LAMP方法有望成为简易的常规检测手段，尤其适用于基层检验检疫机构及现场检验。Yang等[25]针对沙门氏菌的两个不同蛋白区域设计引物，同时用两种LAMP和PCR方法检测沙门氏菌，结果表明两种LAMP方法都高度敏感，是PCR方法的102倍。对比显示，两种LAMP方法都能在带壳蛋中快速精确检测出沙门氏菌血清型, 并有望列入蛋的沙门氏菌检测程序。

3.3 LAMP在寄生虫测中的应用

Isaia等[26]对弓形虫B1和TgOWP基因进行LAMP扩增，并结合免疫荧光试验和PCR，结果显示LAMP灵敏度极高，证实LAMP在弓形虫检测方面快速特异和灵敏的优越性。Hiroka等[27]对纯化后的疟原虫SPECT2基因进行LAMP扩增, 并利用LAMP方法成功检测出一只易被显微镜漏检的仅携带一个卵囊的按蚊, 证实了LAMP方法的高灵敏性。Wang等[28]根据瑟氏泰勒虫P33基因设计引物, 建立了LAMP检测方法, 结果显示LAMP的灵敏度和阳性检出率均高于常规PCR。Matovu 等[29]利用LAMP和PCR方法对锥虫进行比较检测。结果表明PCR方法的用时是LAMP方法的5倍。Nkouawa 等[30]建立了人类链状带绦虫的LAMP检测方法。Sako等[31]用LAMP方法，从寄生虫组织和人类排泄物中成功检测和区分了人类链状带绦虫、猪带绦虫、牛带绦虫和亚洲带绦虫，表明LAMP方法很适合临床样本的检测。

3.4 LAMP在真菌测中的应用

Ludwig等[32]对禾谷镰孢菌的gaoA基因设计引物并建立LAMP检测方法，灵敏性实验结果显示LAMP法对纯化后靶基因的检测极限极低，并且特异性实验证明其只扩增出禾谷镰孢菌DNA，证实了LAMP法的高度特异性。

3.5 支原体的检测

Saito等[33]建立了肺炎支原体的LAMP检测方法，结果表明在阳性样本检出率一致的情况下，LAMP法的检出限值优于RT-PCR法，证明了LAMP方法的高敏感性。Jiahe等[34]根据猪肺炎支原体mhp165基因设计引物并建立了LAMP快速检测方法。灵敏度实验表明10fg DNA在30min内即可被检测到，LAMP技术加速并简化了猪肺炎支原体的检测程序。

3.6 转基因方面的应用

Tao等[35]应用LAMP方法分别针对外源性核酸HbsAg和hATIII设计一套引物来监测转基因山羊。在加入SYBR Green后目测即可见结果，对比发现其比传统PCR方法更敏感快速和简便，证实了LAMP是一种快速准确监测转基因山羊的方法。

4 小结与展望

LAMP技术以其高效快速的特点近年来发展迅速, 为实验室检测提供了一个新途径。由于其简单的操作和试剂盒的开发, 该技术很有可能在未来替代传统核算扩增方法, 由实验室扩展到实地, 更好地应用于基层诊断检测。LAMP技术本身尚存在缺陷,产物易造成污染以及假阳性问题还需改善。总是,随着LAMP技术的进一步完善和成熟, 其必能在病原体基因检测方面发挥重要作用并逐渐应用于临床。

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Loop-mediated Isothermal Amplification Technique and Its Application

ZHAO Lijuan1,2, ZHOU Jie2, GAO Cheng2
(1. College of Veterinary Medicine, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China;2. Shanghai Laboratory Animal Research Center, Shanghai 201203, China)

Loop-mediated isothermal amplification(LAMP) is a novel nucleic acid amplification method.At a certain temperature, LAMP performed only one step to terminate the process. Due to its high efficiency, simplicity, rapidly, high specificity and theResultof LAMP is easily detected by naked eyes,LAMP has been widely applied in the qualitative and quantitative detection of viruses, bacteria and clinical diagnosis of disease. In this paper, we introduced the principle of LAMP and its applicability in molecular detection and diagnosis.

Loop-mediated isothermal amplification(LAMP); Nucleic acid amplification;Gene detection

Q95-33

A

1674-5817(2014)02-0162-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2014.02.018

2013-10-16

上海市科委基金项目(No.11140901002)

赵丽娟(1988-),女, 硕士研究生。研究方向: LAMP技术的应用

周 洁, 女, 副研究员。E-mail: zhoujie0526@163.com