类过氧化物DNA酶在生物传感器领域的研究进展

李森,王源升,2，余红伟,李瑜

1.海军工程大学 理学院化学与材料系，湖北 武汉 430033；2.四川大学 高分子材料工程国家重点实验室，四川 成都 610065

具有催化功能的DNA被称为DNA酶（DNA⁃zyme）或脱氧核酶。众所周知，DNA酶可催化很多反应，包括DNA或RNA的分裂[1-2]、DNA的修饰、共价连接[3-4]、卟啉环的金属化作用等。DNA酶的催化特性已被用于医疗和生物传感等领域。

用DNA酶代替辣根过氧化物酶（HRP）构筑电化学生物传感器，可以结合DNA酶及电化学检测的优点，使其具有独特性能。与传统酶相比，DNA酶价格低廉、稳定，可在较宽的酸度和温度范围使用。

在工业、生物、环境、临床诊断和食品分析等领域，H2O2的测定具有重要意义。多种以HRP或酶-媒介体修饰的电化学传感器已用于H2O2测定[5]。已有许多利用该类DNA酶催化H2O2氧化的报道，但多数集中在比色法[6-7]、荧光[8]和化学发光法[9]的传感研究方面。

DNA分子另一个活跃的应用领域出现在20年前，就是通过适配体识别分子。核酸序列可以有选择地结合目标分子[10]。适配体和DNA酶结合产生了功能核酸，这种组合允许用于检测任何被选定的适配体发现的目标分子。

DNA酶的显著优势刺激了本领域的研究。最近受关注的DNA酶是具有类过氧化酶活性的脱氧核酸酶[11]。本文将关注具有类过氧化物活性的DNA酶在生物分析领域的应用。

1 类过氧化物DNA酶的特性

拥有过氧化物酶活性的DNA酶是在20世纪90年代晚期被Sen等首先报道的[12]。他们注意到酶所包含的氯化血红素作为显示过氧化物酶活性的辅助因子，并且即便不含脱辅酶，氯化血红素也可将过氧化物酶反应催化到一定程度。人们开始寻找一种能够增加氯化血红素催化活性的人工系统。

G-四链体是由富含鸟嘌呤碱基（G）的DNA或RNA序列形成的一种特殊的核酸二级结构[8]。G-四链体DNA酶则是由G-四链体与氯化血红素结合后形成的具有过氧化物酶活性的DNA酶[13]。与一些天然的过氧化物酶相比，G-四链体DNA酶具有价廉、易于制备储存、易于修饰及水解稳定性和热稳定性好等优势。近年来，利用这类DNA酶，已设计了多种化学及生物传感器，包括核酸传感器、金属离子传感器及适配体传感器等。

最早报道的能够增强氯化血红素催化H2O2活性的形成四重折叠结构的序列是一种叫做PS5.M的24核苷酸适体。另一种PS2.M是比PS5.M缩短6个核苷酸的相似体，对卟啉的粘结和对H2O2的催化都展现出更强的作用[8]。

Shangguan等[14]注意到G-四链体和DNA酶催化活性的关系，这和粘结氯化血红素的能力息息相关。有着平行链的四分子结构展现出低过氧化物酶活性，且单分子逆平行的四折叠结构表现出较低的酶作用。据观察，有最强活性的是平行或混合型的分子内四折叠结构[15]。G-四链体的布局也会受到并列阳离子类型、G-4平面数量和环状物组织的影响。

阳离子的存在对于四折叠结构的形成是必需的。早期研究表明，钾离子对于四折叠结构的形成和催化活性是必需的。然而，近期的报道显示其他的离子也可以被利用，并且在一些情况下，用铵离子取代钾离子会更有效地促进酶的活性。Nakayama和Sintim[5]注意到了铵离子的存在降低了寡核苷酸氧化降解的危险。

为了观察DNA酶的活性，需要进行一个合适的指示剂反应。双氧水存在时，ABTS的氧化会产生有色产物，并且吸收光谱的变化会被用于监测反应进程。发光氨和双氧水的反应会产生化学发光，其强度可被视为催化信号。对于和ABTS的反应，Shen等[16]发现添加ATP会对酶的活性产生积极作用。ATP隐藏了ABTS·+的不均衡，让ABTS成为类过氧化物酶反应的良好基底[17]。Wang等[18]的研究表明过氧化物酶的活性依赖于双氧水而不是基底浓度。这个结论显示了DNA酶与HRP相比所不同的反应机理：活性随着ABTS的浓度而增强。在DNA酶催化的反应中，氧从双氧水转移到Fe（Ⅲ）是一个速率受限的步骤，下一步（包含ABTS氧化）的速率并不影响总体反应速率[18]。

2 在检测领域的应用

2.1 DNA检测

类过氧化物DNA酶活性在DNA检测中已经有了很多应用[9,19]。DNA检测都是建立在DNA杂交的基础上的。人们提出了许多利用脱氧核酶进行DNA检测的不同方法。

Willner等[9]报道了一种用于目标DNA检测的化学发光方法。生物化学发光一般采用酶激活化学发光。DNA样品与探针杂交后，与化学发光底物酶结合，随即加入化学发光底物，由于化学发光底物酶可激活底物发光，便可通过探测化学发光强度得知分子杂交情况。与部分目标DNA互补的寡核苷酸探针A被添加在金电极表面。报道DNA链（B）由2部分组成，一个负责催化活性（G-四链体），另一个可以黏接到目标DNA的互补区域。目标DNA与酶标记的报道链杂交，被金表面的寡核苷酸探针捕获，被后来添加的发光氨和双氧水追踪，产生发光信号。

在另一个应用中，同一个研究团队以一个催化分子信标作为杂交探针用于DNA探测[19]。分子信标是一段与特定核酸互补的DNA探针，空间结构上呈发夹结构，包含能产生G-四链体的A、B片段，A片段是与靶DNA互补的探针，由于发夹结构包含了茎环杂交片段B，不能形成DNA酶。当DNA分析物存在时，就可以和发夹环杂交，导致发夹打开，释放片段B，当存在氯化血红素时就会产生DNA酶。把ABTS和双氧水加入溶液中就会产生比色度读数。

金纳米颗粒的应用也被报道过[20]。有一个片段部分互补于分析DNA的硫化核酸探针，被固定于金电极表面。探针有能力去捕捉目标DNA，且目标DNA的未杂交部分可以和携带DNA链段的纳米金颗粒相互作用，DNA链由限制在与目标DNA互补的片段上的DNA酶组成。因为每个纳米金颗粒都携带了许多DNA酶单元，导致金电极表面的纳米金颗粒的杂交和催化信号显著放大。经过表面的清洗，添加双氧水和发光氨，就会观察到发光作用。

四折叠结构也能由2条DNA链形成，Willner等用这种方法建立了一个DNA传感器[21]。这些两两的寡核苷酸形成DNA酶片段，且能携带互补于DNA分析物的序列。如果目标DNA与2条链一起杂交，四折叠结构就不能形成，也不会检测到信号。不含目标DNA的控制实验包含与氯化血红素形成DNA酶，并且加入发光氨和双氧水会产生发光信号。

Mao等[22]提出了一个新颖的两步信号放大法进行DNA探测，第一步涉及蛋白酶，第二步涉及DNA酶。DNA分析物作为滚环扩增反应的引子，产生了一个能形成DNA酶的重复序列线性链段。在该方法中，用作RCA反应的环状模板包含2个片段，一部分互补于分析物，另一部分互补于四折叠结构。当存在dNTPS时，DNA聚合酶拉长了被模板杂交的目标DNA链，产生了许多DNA酶结合域。下一步，加入氯化血红素会导致活泼的脱氧核酶的形成，氧化ABTS并给出发光信号。该方法利用了双倍放大，考虑到目标DNA在pmol/L浓度水平，其中许多DNA酶结合域由单个目标DNA酶产生，并且每个DNA酶随后氧化了许多DNA酶结合域。

Willner等[23]介绍了一种全新、复杂的基于自组装核酸结构和DNA酶串联反应的杂交试验。这个结构包含了3条核酸链。分子A和B对于DNA分析物部分互补，但也拥有允许它们黏接在准循环DNA（C）上的序列；核酸C包含1个核糖碱基（rA）和2个能够形成四折叠结构的片段。当一个DNA分析物出现时，所有的部分会被连接成一个超分子结构。这个结构包含2个环状物，产生了一个以rA做基质的依赖镁离子的DNA酶。加入镁离子后，出现了DNA分裂，并且释放能够形成四折叠结构的序列。随后和氯化血红素复合，再利用ABTS氧化的比色分析法进行目标DNA的检测。

Willner等提出了另一个用于DNA放大检测的独立方法[24]。该试验通过发卡结构和分析物的杂交，形成了一个能够被FOKI核酸内切酶识别的位点。由于核酸内切酶的活性，这个结构不对称地分裂了，释放了一个能形成类过氧化物酶的DNA酶序列。加入氯化血红素、双氧水和发光氨后，脱氧核酶催化这个反应，并产生了一个发光信号。除了DNA酶，分裂过程产生了其他2个产物。一条链不能用于随后的反应，另一条链是形成类过氧化物DNA酶的反应催化剂。催化剂和另一个发卡结构黏接在一起，提供了一个用于FOKI的新的黏接位点。这个过程可以反复地产生类过氧化物DNA酶、废品和催化剂。这个试验也可被用于其他DNA序列，这些序列包含适合产生FOKI结合位点的碱基域。

DNA酶已被用于检测致病微生物的DNA，如沙门菌、分支杆菌等[25]。Mahesh等开发了两步法用于这方面的分析。第一步包括一个不对称的PCR反应，第二步利用分析序列的杂交，这个序列带有两半由一段与目标DNA互补的序列所连接的分裂DNA酶。杂交之后，两半的DNA酶序列形成了一个四折叠结构，且结合了氯化血红素获得了类过氧物酶的活性。只有目标DNA和探针杂交，使用不对称的PCR技术使互补DNA分子得到排出，才能消除和DNA链段之间的相互作用。从细菌提取物中得到的DNA分析物，在70次循环中以10 μL的反应量得到放大，通过对PCR产物的视觉检测从而得到评定。

2.2 金属离子检测

G-四链体的形成是一个依赖金属离子的过程，因此，人们对使用DNA酶的金属离子检测充满了兴趣[26-28]。Wang等提出DNA酶催化活性是由钾离子有选择地引发的。他们为了证明钾离子选择性的假设，以TMB作为DNA酶活性指示剂和其他离子进行了相当数量的试验。TMB氧化时形成了2个产物，一个显示蓝色，用强酸结束反应后形成了另一个黄色产物。这个反应使钾离子能够被裸眼观察到。该实验也被用于现实样品中钾离子的确定，比如血清。然而，Nakayama等[29]报道，G-四链体在铵离子存在时比钾离子能够展现出更强的催化活性。这些矛盾的结论显示了四折叠结构和指示剂反应在DNA酶的金属阳离子选择上的重要性。

人们探索了许多确定铅元素的试验方法，问题在于是否能在一个低于指定水平的浓度监测有毒金属。Dong等[28,30]进行了一个类过氧化物DNA酶为指示剂标记的检测铅离子的试验。他们注意到铅离子导致了钾离子四链结构的重排，并且导致四折叠结构不能显示催化活性。DNA酶催化活性的减弱和加入钾离子样品中铅离子的浓度大小是相对应的。DNA酶被铅离子影响而产生变构规律，其具体表现就像一种抑制物，并且把DNA酶的活性模式转变为非活性。这种方法显示催化核酸不仅能像蛋白酶一样显示催化活性，也可以受到规律机理的支配。

另外一个对环境和人类健康产生危害的污染物是汞。为了检测环境中的汞离子，人们开发了许多传感器，包括类过氧化物DNA酶。已经应用的有2种，并且都是基于2个胸腺嘧啶与汞离子结合形成一个T-Hg+-T复合物[18,31]。此结合也被用于将单链DNA折叠成双链DNA，加强DNA双链结构[32]，激活DNA酶。

Wang等[18]设计了允许汞的比色度检验降低到50 nmol/L的方法。他们利用富含胸腺嘧啶残基的寡核苷酸，这些胸腺嘧啶能形成有催化活性的四折叠结构，存在钾和氯化血红素时，就形成了DNA酶，加入双氧水和ABTS后能够观察到催化活性。加入汞离子后破坏四折叠结构，并且抑制酶活性的THg2+-T碱基对形成。

Shen等提出了一个不同的方法，就是利用THg+-T碱基对检测汞离子[31]。这是一种在汞离子存在的情况下检测催化活性的“打开”传感器。含胸腺嘧啶的残留物中被加入寡核苷酸的5′端，这些寡核苷酸可形成分子间的四折叠结构。由于在汞离子存在的情况下形成了T-T碱基对，四链体的折叠变得容易，并且催化活性效率也增加了。此方法对汞离子的检测限是19 nmol/L。

Shen等[33]提出了一个实验，用类过氧化物DNA酶检测银离子。类似汞离子，银离子可以和核苷酸形成复合物。当银离子存在时，就会形成C-Ag+-C碱基对。特定的结合是设计寡核苷酸的基础，这些寡核苷酸在银离子的影响下可以折叠成四折叠结构。这个方法用ABTS氧化的色度指标反应。利用该方法可以测定浓度低于20 nmol/L的银离子。

Xie等[34]提出了一种用作铜（Ⅱ）比色检测的变构双DNA酶的单分子探针。此测定法利用由3个片段组成的寡核苷酸。第一域（A）是用作DNA裂解活性的脱氧核酶的基底，中域包含一段能形成四折叠结构和展示过氧化物酶活性的序列，第三域包含一个依赖铜离子的DNA裂解脱氧核酶。当没有铜离子时，DNA裂解脱氧核酶被激活，并且裂解了DNA基底。由于释放了中域，活跃的类过氧化物酶脱氧核酶形成。吸光度的变化（从与H2O2反应的TMB得到的）与铜离子浓度成正比。这种方法的灵敏度是1 μmol/L铜离子。

2.3 DNA酶与适配体组成适体传感器

适体传感器是能对低分子量基底或蛋白质显示特定黏结性的DNA或RNA分子[35]。通过在体外筛选和PCR技术扩增，这些分子可以相对容易地获得。适配体在传感应用中可被作为适体传感器。在适配体-DNA酶结合物中，适配体是一个识别元件，而脱氧核酶产生解析信号。由于二者都是DNA寡核苷酸，因此很容易获得二者的结合物。由于这些优势，使其成为解析AMP和可卡因等小分子的特定、灵敏的工具[36]。这些结合后的DNA探针被称为变构适体传感器。

我们提出了一种基于DNA酶的适配体无标记检测腺苷的方法，所设计的适配体DNA序列内包含2个功能域：一个是配体结合域，用于对特定目标物的响应；一个是酶催化元件，在合适条件下催化特定的反应体系产生可检测的信号。没有特定配体时，催化元件由于不合适的结构折叠而不具有酶功能，引入配体使适体产生适当折叠，发卡结构打开，加入氯化血红素，引起特定的DNA序列产生构象变化，与氯化血红素形成具有催化功能的G-4螺旋结构，对底物体系产生催化作用，产生电化学信号。

Willner等[35]提出了一个用于AMP检测的基于DNA酶的适配体。在适体和AMP的复合物形成后，脱氧核酶给出了一个比色信号。该方法可以检测浓度低至4 μmol/L的AMP。核酸拥有2个片段，A代表一段AMP适配体序列，B富含鸟嘌呤碱基，并且在氯化血红素存在时形成具有过氧化物酶活性的DNA酶。核酸探针被阻断剂杂交，它有一段序列和片段A和B互补。适配体-AMP复合物的形成引起阻断剂和探针核酸之间杂交的解离，链段B被释放，并可以与显示类过氧化物酶活性的氯化血红素形成一个四折叠结构配合物。阻断剂-核酸双螺旋结构的去杂交只有在AMP分子出现时才能发生。

Willner也提出了另一种替代方法，用于没有阻断剂分子时AMP的探测[37]。该核酸探针包含2个域，分别是AMP和可卡因的适配体。根据不同的目的，AMP或可卡因都能被这个适配体传感器检测出来。信标核酸包括2个域，能够与适体序列杂交，其中一个域在氯化血红素的存在下可折叠成具有过氧化物酶活性的脱氧核酶。靶分子与相应的适配体的结合导致了由探针和信标寡核苷酸形成的双螺旋体的去杂交。加入氯化血红素、H2O2和ABTS后，就会观测到吸光度的变化。这个传感器可以检测低至5 μmol/L的AMP和低至0.1 μmol/L的可卡因。

Deng提出了另一个适配体检测腺苷的方法[38]。通过合并一个腺苷适配体和裂成两半的类过氧化物DNA酶，可以获得一个变构传感器。链段1，一个58链节的寡核苷酸，由3个域（A、B和C）组成。片段A可以和包含片段D的链2杂交。域B是捕获腺苷的适体。片段C和D在氯化血红素存在时可形成活性脱氧核酶。在没有目标分子的情况下，域B具有足够的灵活性，允许片段C和D形成G-四链体。然而，当存在腺苷时，域B采用特定结合目标分子的二次结构，DNA酶的两半相隔很远，以至于二者不能杂交成一个G-四折叠结构。腺苷的存在导致吸光度的下降与被分析物的浓度成正比。用本适体传感器，腺苷可在6 μmol/L的水平得到检测。

许多使用脱氧核酶的分析系统被用来检测凝血酶。TBA（凝血酶结合适体）是一个15链节的寡核苷酸，能结合G-四链结构的凝血酶。在钾离子存在时，它可以作为具有过氧化物酶活性的DNA酶。该复合物通过H2O2催化ABTS的氧化。Dong等[39]报道了基于脱氧核酶的凝血酶传感器，检出限为20 nmol/L，这种脱氧核酶也可用于测定其他蛋白质[7]。核仁蛋白是人类癌症细胞的蛋白质标记，DNA寡核苷酸AGRO100是该蛋白的适配体。适体-蛋白质复合物的形成，抑制了DNA的复制和细胞增殖，AGRO100可用于抗癌治疗。能够抑制HIV-1整合酶的G-四链体适配体的研究也在进行中。适配体T30695和93del显示了过氧化物酶活性，并可被用于HIV-1和整合酶的检测[7]。

2.4 单核苷酸多态性检测

单核苷酸多态性（SNP）在基因组DNA变异中是最常见的类型。SNP最重要的应用是诊断遗传性疾病。SNP分析的重要性导致测定数量的显著发展。这些方法都基于杂交、酶活性测量或其他复杂的反应，大多数情况下非常耗时。Kolpashchikov等以过氧化物酶脱氧核酶作为信号探针[40]，发现SNP可能会影响阿尔茨海默症患病的风险。与DNA分析物部分互补的寡核苷酸被分成两部分，并且与能够形成脱氧核酶的许多半序列通过三甘醇连接子连接起来。在有DNA分析物存在的情况下，它们和探针杂交，并且DNA酶序列的两半足够近以形成一个四折叠结构，加入氯化血红素和双氧水后还要经历基底的氧化作用。DNA酶的过氧化物酶活性对于一个带有SNP的DNA分子的系统来说是相对低的，并且可与在没有任何靶DNA时的活性相媲美。

2.5 其他应用

Yao等用具有过氧化物酶活性的脱氧核酶检测其他分子的酶活性。他们公布了检测甲基转移酶和抗氧化剂的实验结果。甲基转移酶催化DNA的甲基化，这在基因表达调制中是一个非常重要的过程。研究已表明，不正确的DNA甲基化是一种癌症生物标志物，这使得甲基转移酶成为抗癌治疗的一个潜在目标。转移酶活性检测的多数方法是费时且昂贵的，或需要放射性标记。为了克服这些缺点，Yao等提出了一个针对甲基转移酶活性的DNA酶试验[41]。发夹脱氧核酶探针由能够形成核酶和转移酶活性识别位点的序列组成。在没有转移酶的情况下，发夹结构可以防止活性脱氧核酶的形成。在测定溶液中，甲基转移酶和核酸内切酶（DpnⅠ）都存在。核酸内切酶切割了探针DNA的甲基化位点，因此，能够形成过氧化物酶活性的脱氧核酶序列被分离，并且氧化ABTS使比色读出。这个方法使甲基转移酶活性的检测限低至6 U/mL。

自由基反应引起重要细胞成分，如DNA、蛋白质或脂类的降解。抗氧化剂可防止自由基所造成的损害，因此，监测活生物体中的抗氧化剂的活性很有必要。通常采用的方法（ESR、荧光标记）具有较低的敏感性，且价格昂贵，耗费人力。使用脱氧核酶则更便宜方便，并具有良好的灵敏度[42]。在氯化血红素的存在下，能够形成四链体的序列显示类过氧化物酶活性，导致ABTS的氧化。在供氢体的存在下，抗氧化剂可以捕捉氧化分子并使其回到初级状态。吸光度读数的减少正比于所分析的样品中抗氧化剂的活性。

3 结语

在各种不同的生物分析中，具有类过氧化物酶活性的脱氧核酶得到了广泛应用。良好的热稳定性、易于结合适配体，使其成为各种蛋白质跟踪分析传感系统的理想选择。大多数传感器通过缓冲溶液中的模型分析物进行开发和测试[43-44]。对于实际诊断和环境监测，应对基质效应进行排查。因此，需要更多的研究来优化感知系统，消除基质效应。

大部分生物传感器系统采用了PS2.M被选择的序列，因为其较强的过氧化物酶活性，该序列能在体外进行筛选。然而，能够形成G-四链结构的富含鸟嘌呤的基因组序列还有很多例子。因此，人们期望这样一个序列生成的脱氧核酶可以表现出类过氧化物酶的活性。这种端粒酶活性的测定方法最近有报导[45]。弱的催化活性已被用于人类端粒G-四链体的存在下生产的端粒酶的TMB底物氧化。

另一方面，目前大多数方法是基于使用数量非常有限基底的比色度读数。为了提高以脱氧核酶为基础的传感器设计的灵活性，需要新的信号传导策略。这种尝试最近已由Nakayama等[46]报道。作者确定了几种酚和以荧光素作为荧光底物的衍生物，可以在氯化血红素-G-四链体的复合物存在时被氧化成荧光产物。鉴于荧光法的众多优点，如良好的灵敏度、宽动态范围、多信号检测选项（荧光强度、各向异性和寿命荧光能量共振转移），现在需要对新的荧光底物展开探索。

考虑到放大检测的巨大潜力、良好的选择性和传感系统的良好操作性，可以预料基于脱氧核酶的传感器将会获得持续快速的发展和进步。

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