浅谈精原干细胞研究进展

姜颖，潘庆杰

青岛农业大学 动物生殖发育与基因工程研究所，山东 青岛 266109

在精子发生过程中，精原干细胞（spermatogoni⁃al stem cells，SSC）是关键的中间环节之一。精原干细胞一方面能够进行自我更新来维持体内雄性配子库数目的相对恒定；另一方面能够定向分化，在分化的过程中产生不同类型的精原细胞，最后形成精子。精原干细胞又是动物体内惟一能将遗传信息传递给下一代的具有可塑性的成体干细胞类型。由于放化疗对生殖细胞的影响及某些雄性动物先天的生殖缺陷，将体外培养的精原干细胞进行移植可恢复不育雄性动物的生育能力。此外，对体外培养的精原干细胞进行转基因，可以获得优良品种的后代或用于保存物种资源。

1 生物学特性

精原干细胞来源于原始生殖细胞（primordial germ cells，PGC）。原始生殖细胞在胚胎发育早期产生、迁移和定位后，在周围环境的诱发下分化为性原细胞（gonocytes），随着生精小管管腔形成，性原细胞逐渐迁移至曲精细管基底层，出生后的性原细胞已达到一定数量且转变为精原干细胞，直至青春期，SSC开始进行精子发生循环。Dym[1]和Clermont等[2]通过苏木精对细胞核着色的不同，将灵长类睾丸中未分化的精原细胞分为2种类型，一种是Ad型精原细胞（dark type A spermatogonia），也被形象地描述为储备干细胞，在青春期后有丝分裂保持静止状态；另一种是Ap型精原细胞（pale type A spermatogo⁃nia），也被形象地描述为自我更新干细胞，有丝分裂保持活跃状态。Hermann等认为啮齿类动物未分化的精原干细胞包含 As到 Aal（16）之间的细胞类型[3]。目前只有As型（type A-single）细胞能够进行自我更新或分裂产生通过间桥相连的2个细胞，被称为Apr型（type A-paired）细胞；Apr型细胞进一步有丝分裂产生间桥连接的4、8、16个细胞的Aal型（type A-aligned）细胞。Apr和Aal为精原干细胞分化的中间过度类型，Aal通过不断的有丝分裂，分别形成A1、A2、A3、A4、In（中间型）和B型精原细胞，之后经2次减数分裂分别形成初级精母细胞和次级精母细胞，再分化为精子细胞，最终形成精子[4]。

2 分离与培养

2.1 分离的时间选取与纯化方法

在动物体内精原干细胞的数量极少，仅占生精细胞总数的0.02%～0.03%[5]。为了深入研究SSC，分离不同动物SSC的时间选取尤为重要。分离过早，SSC还未完全形成；分离过晚，随着动物睾丸的成熟，SSC开始分化为不同类型的精原细胞，纯化后杂质细胞较多。因此，一般选取出生后不久或青春期前的动物来分离和培养精原干细胞。小鼠选用出生后6～8 d，大鼠选用9～10 d，兔选用1个月以内，鸡选用15～19 d鸡胚[6]，牛的最适期为5～7月龄[7]，羊为4月龄[8]，猪为1月龄[9]。

由于睾丸中存在多种类型的细胞，所以分离后的SSC要进行纯化。目前应用的纯化方法主要有盘化法、差速贴壁法、Percoll不连续密度梯度离心法、免疫磁珠分选法和流式细胞仪分选法。张秀娟等[10]比较了差速贴壁法和Percoll不连续密度法对SSC的纯化效果，发现Percoll不连续密度梯度法纯化后的细胞与纯化前的细胞总量无论在回收细胞比率还是AP阳性率上都低于差速贴壁法。免疫磁珠分选法和流式细胞仪分选法都是利用细胞表面表型来纯化细胞。免疫磁珠分选法是使细胞表面的特异表面抗原结合抗体，然后与磁珠偶联筛选出阳性细胞，最后收集阳性细胞；流式细胞仪分选是使细胞表面标记结合荧光素标记抗体，再经流式细胞仪分选。但由于流式细胞仪对细胞损伤较大而多选用免疫磁珠分选法，流式细胞仪分选法多用于检测细胞类型。

2.2 体外培养

适当的培养条件可使纯化的SSC提高增殖效率、维持干细胞状态、延长存活时间。所以要尽量在体外创造动物体内的微环境，其中饲养层的选取是创造良好微环境的第一步。小鼠胚胎成纤维细胞饲养层（mouse embryonic fibroblast，MEF）是最基本的一种饲养层，目前常用的培养精原干细胞的饲养层还有睾丸支持细胞饲养层和STO细胞饲养层等。培养基和血清的选取在不同的实验中均有报道，但目前还没有固定的配制方案，可根据实验物种及实验条件选取最适配方。在体外培养SSC时必须添加的是细胞因子，其中胶质细胞源性神经营养因子（gli⁃al cell line-derived neurotrophic factor，GDNF）是支持细胞分泌的能促进精原干细胞增殖的一种细胞因子。实验发现，不添加鼠白血病抑制因子（mouse leukemia inhibitory factor，LIF）组的SSC活细胞数量比单因子添加组显著减少，组合添加LIF、GDNF和碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）可促进 SSC的增殖[10]。孙大林[11]指出，在干细胞存活、分裂增殖及克隆形成等方面，bFGF、干细胞因子（stem cell factor,SCF）和可溶性的GFR-α1（GDNF的受体）等起到促进作用。陈晓宇等[12]分离SSC后进一步纯化，比较了差速贴壁法和盘化法，发现盘化法处理后的SSC在形态上比差速贴壁法处理的SSC更均一，而且形成集落的AKP阳性率也明显高于差速贴壁法，但SSC经差速贴壁法处理后在集落形成时间和集落数方面都优于盘化法，认为造成这一现象的原因可能是差速贴壁法在纯化细胞过程中掺入了一些体细胞，导致集落在生长速度和出现时间方面表现出大幅的跳跃。

微滴培养法是一种新兴的培养方法，Brinster首次将微滴培养法用于卵子和胚胎的培养，指出微滴培养在观察卵子和胚胎及收集数据资料方面有显著效果[13]。Yasuyuki[14]将微滴培养法用于培养SSC，发现石蜡油可以保护细胞免受污染，减少蒸发，并且能够保持温度和pH值的稳定。有研究指出，通过覆盖液体油滴，不仅可维持正常的培养液渗透压，而且可以保证培养液内细胞对营养的需要，从而为细胞提供一个理想的生长环境[15]。

3 鉴定

体外培养的SSC贴壁速度慢，支持细胞贴壁速度较快且逐渐呈不规则形状生长平铺培养皿。精原干细胞呈圆形或椭圆形，细胞核大，胞浆少且折光性强，常染色质多而异染色质少。培养初期精原干细胞呈单个细胞或几个成团存在，随着培养时间的增加，以链状或葡萄串状的集落形态存在。

AKP染色常用来检测细胞的干性，因为未分化的多能干细胞膜上有高水平的碱性磷酸酶表达[16]。精原干细胞也是干细胞，具有分化潜能，所以AKP常作为鉴定SSC的方法之一。

用免疫细胞化学技术检测SSC表面的不同标志物是鉴定SSC的另一重要手段。常用的SSC细胞表面标志物有β1整合素、α6整合素、Thy-1、Oct4、Stra8、GFRα-1和c-kit。Shinohara等[17]利用β1或α6整合素抗体筛选小鼠睾丸体细胞，在受体睾丸中可见克隆显著增加且有供体来源的精子发生，随后运用生物功能检测系统证明β1和α6整合素是与精原干细胞相关的抗原。Thy-1（CD90）是免疫球蛋白超家族中的一种糖蛋白，它在包括小鼠精原干细胞在内的许多干细胞中表达[18]。Oct-4是首个发现的只在多能干细胞中表达的转录因子，为核特异表达，因此不仅成为检测干细胞的标志物之一，而且成为控制胚胎干细胞多能性的主要因子[19]。研究发现，在未分化的组织中Oct-4有较强的表达[20]。Stra8是生殖细胞特异的标志物之一，Oulad-Abdelghani等[21]证实在减数分裂前有Stra8的表达。Koubova等[22]发现睾丸组织Stra8的表达可通过视黄酸（RA）得到激活。Naugh⁃ton等[23]研究表明，GFRα-1受体存在于生殖细胞，在新生小鼠的性原细胞中表达，但在正常精子发生过程中受到抑制，其对小鼠SSC自我更新有重要作用。c-kit是SCF的受体，SCF由支持细胞分泌，c-kit存在于细胞膜上且在减数分裂后不表达。Ohta等[24]发现c-kit在用于分化的A型精原干细胞中表达，在不用于分化的A型精原干细胞中不表达，推测c-kit在用于分化的A型精原干细胞到B型精原细胞间表达。其他表面标志物还有SSEA-1[25]、c-Ret[26]、CD9[27]、CD24、CD34、Ngn3[28]、EpCam[29]和PGP9.5[30]等。

在对SSC的研究中，寻找SSC特异表面标记的脚步从未停歇，通过表面标志物的结合可提高鉴定SSC的正确性。

4 移植及精原干细胞介导的转基因

随着研究的不断深入，SSC体外培养时间不断延长，但由于SSC还没有特异的分子标志物，所以准确鉴定SSC的标准就是将SSC移植到不能产生雄性配子的雄性动物的曲精细管内，一段时间后检测受体睾丸内是否有雄性配子产生。目前，使可育的雄性动物失去产生雄性配子功能的方法主要有白消安处理和射线处理。1994年，Brinster等[31]首次将供体小鼠睾丸中的精原干细胞移植到因用白消安处理而无雄性配子产生的同种小鼠睾丸中，结果发现受体能进行精子发生过程，这一移植实验的成功为后续SSC介导的转基因技术的发展奠定了基础。

SSC介导的转基因技术分为SSC体内介导转基因技术和体外介导转基因技术。SSC体内介导转基因技术即利用表达载体携带外源基因，借助于表达载体的特殊作用和基因导入方法，使外源基因进入SSC并整合到基因组中，以产生携带有外源基因的精子，最终制备转基因动物[32]。在研究中虽然有转基因的后代产生，但Virginie等[33]认为睾丸中包含精原干细胞到精子不同阶段的存在形式，外源基因在整合时不一定发生在精子形成的什么阶段，且SSC体内介导转基因技术效率很低，产生正常精子的效率更低。与SSC体内介导转基因技术相比，SSC体外介导转基因技术的应用效率更高。利用体外培养的SSC进行转基因来获得所需后代，主要有以下几种方法：一种是将携带目的基因的SSC通过体外诱导分化为精子，然后与卵子体外受精后移植到受体动物体内产生表达目的基因的后代；另一种是将转基因的SSC移植到同种不可育或免疫缺陷雄性动物睾丸内产生表达目的基因的精子，再通过自然交配或体外受精产生后代。有研究指出，有些动物通过异种移植精原干细胞也可以产生供体精子，但是受体动物都是未成熟且内源性精子发生已破坏的免疫缺陷动物[32]。据此，是否可以利用未成熟、不育且免疫缺陷的异种动物睾丸来为SSC提供体内精子发生的良好微环境，而后收集精液体外受精来得到所需后代，是一个有待研究的问题。由于SSC的体外培养体系还不够完善，使SSC能长期培养、传代而不分化还处于探索阶段，技术水平也比较滞后，还须进一步深入研究。

5 结语

目前，小动物精原干细胞的研究进展比较显著，精原干细胞可在体外培养较长时间，并且能进行基因操作和移植。由于精原干细胞目前还没有特异性标志物，在动物体内含量极少，且受限于技术条件，大型动物精原干细胞的研究还比较缓慢，探索道路也比较漫长。但精原干细胞的应用潜能是不可忽视的，其研究在医学、干细胞生物学、分子细胞生物学和发育生物学等领域都具有重要的应用前景。

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