蛹虫草在河南省的新发现、鉴定与特性

李 锋， 程 雁， 冯 菲， 宁 萌， 陈晓飞， 孙玉飞， 周伏忠

(河南省微生物工程重点实验室，河南省科学院生物研究所有限责任公司，河南 郑州 450008)

蛹虫草(Cordycepsmilitaris)，又名北冬虫夏草、北虫草、蛹草，属子囊菌门Ascomycota、 盘菌亚门Pezizomycotina、粪壳菌纲Sordariomycetes、肉座菌亚纲Hypocreomycetidae、肉座菌目Hypocreales、虫草菌科Cordycipitaceae，是虫草属Cordyceps的模式种[1].该菌能寄生多种鳞翅目昆虫幼虫及蛹，是一种具有食用和药用价值的大型真菌.药理学研究表明,蛹虫草具有“性平、味甘、益肺肾、补精髓、止血化痰”的功效，具有明显的镇静、抗疲劳、抗肿瘤等功效，能显著增强非特异性免疫系统及促进抗体形成，具有良好的医用价值和保健作用[2,3].蛹虫草与中国传统名贵中药冬虫夏草(Ophiocordycepssinense)在药化和药理上十分相似，有些成分甚至远高于冬虫夏草，因此在功能食品、医药和生物学技术等方面有较高的实用价值，可以作为冬虫夏草的代用品[3,4].

蛹虫草的生态适应幅度大，广泛分布于世界各地，包括中国、美国、俄罗斯、加拿大、意大利等国，在中国的吉林、湖北、贵州、云南、四川等省均有发现[5].野生蛹虫草大多生长在海拔100～2 500 m的山区，适宜含水量20%～25%、pH值6.5的微酸性土壤，多为棕壤土、紫红壤土等腐殖质土壤.它的自然发生季节一般为6～9月份，气温15～25 ℃，空气相对湿度60%～85%，郁闭度60%的针阔混交林地[3].

笔者在河南省汝阳县的伏牛山区进行生态调查时，首次在该地区发现了蛹虫草的存在，这增加了蛹虫草在中国的分布地区.通过对菌株分离、形态鉴定和分子鉴定以及人工培养、纤溶活性测定等分析，为蛹虫草这一珍稀自然资源的利用提供了基础.

1 材料与方法

1.1野生蛹虫草的生长环境调查与外观特征

观测蛹虫草在发现地的生长环境，记录发现蛹虫草的地理位置.同时采集数株野生蛹虫草，肉眼观测并记录外观形态，并带回实验室中进行菌株的分离与鉴定.

1.2蛹虫草菌株的分离与形态学鉴定

将采集的新鲜蛹虫草用清水洗去表面浮土，置于体积分数75%乙醇中表面消毒2 min，在无菌水中反复冲洗，置于无菌滤纸上晾干.用无菌解剖刀将消毒后的虫草子座切成长度0.5～1.0 cm 的小段，接种于PDA 培养基平板上，放置于22 ℃的培养箱中倒置培养.菌丝萌发生长后，选择无污染的菌丝，转接到新的PDA 培养基平板上进一步培养，最终得到纯化的蛹虫草菌株，命名为ycc-ry-01.

将蛹虫草菌株ycc-ry-01接种于PDA培养基平板上，置于22 ℃下黑暗培养5 d，随后转移至光照(12 h)与黑暗(12 h)交替条件下继续培养5～7 d.每天观察菌落形态变化、菌丝的长势和菌落颜色变化.

蛹虫草菌丝体以乳酸石碳酸棉兰溶液制片，野生蛹虫草的子座做切片，用光学显微镜观察形态，分类检索参照文献资料[6].

1.3蛹虫草菌株的分子鉴定

1.3.1 基因组DNA的提取 采用CTAB 法提取野生蛹虫草和分离培养后的菌株ycc-ry-01菌丝体基因组DNA.取适量子座或菌丝体置于研钵中，加入液氮冷冻研磨成粉末状后转移到灭菌离心管，加入600 μL CTAB 缓冲液(NaCl 1.4 mol；CTAB质量浓度 2%；Tris-HCl 100 mmol，pH值8.0；EDTA 20 mmol，pH值8.0)于65 ℃温育40 min，中间反复颠倒3～5次.冷却到室温后12 000 r·min-1离心10 min，取上清液加入等体积的Tris饱和酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)抽提2次，用氯仿/异戊醇(24∶1)抽提2次.小心吸取上层水相，加入等体积的异丙醇，轻微颠倒试管几次使样品混匀，置于4 ℃冰箱中过夜.12 000 r·min-1离心10 min，弃上清，用体积分数70%乙醇清洗沉淀2～3 次，干燥后用TE 缓冲液溶解沉淀，-20 ℃保存备用；同时取5 μL样品在质量分数0.8%琼脂糖凝胶中电泳检测.

1.3.2 PCR扩增 采用真核生物扩增转录间隔区通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)进行ITS1-5.8SrDNA-ITS2片段的扩增.PCR反应体系为：基因组DNA 2 μL、10×PCR buffer 5 μL、Taq DNA 聚合酶2.5 Unit、dNTP(2.5mM) 4 μL、引物ITS1和ITS4 (10 μM)各2 μL，用去离子水补至50 μL.反应程序为：95℃预变性5 min 后进入循环，94 ℃变性50 s、53 ℃退火40 s、72 ℃延伸60 s，共进行30个循环，最后于72 ℃下延伸10 min.PCR 产物用质量分数1.2 %琼脂糖凝胶电泳检测，样品送交北京华大生物技术有限公司测序.

1.3.3 序列比对与系统发育树的构建 测序结果提交到GenBank 核酸序列数据库，应用BLASTN 程序对获得的ITS1-5.8SrDNA-ITS2序列进行相似性比对.下载虫草属(Cordyceps)相似的物种菌株的ITS序列进行系统发育树的构建，用ClustalX 2.0 软件处理分析获得菌株的ITS 序列，用MEGA 5.0软件采用最大似然法构建NJ系统发育树，根据系统发育树探讨其亲缘关系.

1.4蛹虫草菌株的人工栽培培养

以大米培养基为基质对菌株ycc-ry-01进行了人工栽培培养，同时以菌株ycc-jzc(来自河南省科学院食用菌工程技术中心)作为对照菌株.具体操作过程为：将2种菌株分别接种于PDA 培养基斜面上，22 ℃培养7 d进行活化.将活化后的菌种分别接入50 mL PDA液体培养基的三角瓶中，22 ℃震荡培养5 d作为液体菌种.将30 g 大米和35 mL营养液(100 g·L-1马铃薯煎汁1 000 mL；KH2PO42 g；MgSO41 g；柠檬酸铵 1 g；葡萄糖1 g；蛋白胨 1 g；维生素B1，50 mg)装入罐头瓶后用耐高温塑料膜扎紧，121 ℃灭菌40 min.取5 mL不同菌株的液体菌种，无菌操作接入瓶内大米培养基上，22 ℃黑暗条件下培养7 d.待菌丝长满培养基后，移置于光照下处理，继续培养7 d 后在塑料膜上打孔，增加通气量.再继续培养20～50 d，观察子座的形成与生长情况.

1.5蛹虫草菌株的纤溶活性测定

采用琼脂糖-纤维蛋白平板法测定纤溶活性.菌株ycc-ry-01和菌株ycc-jzc分别采用黄豆培养基(黄豆100 g煎汁30 min、蔗糖20 g、酵母粉2.5 g、MgSO41.5 g，补充水至1 000 mL)、淀粉培养基(可溶性淀粉20 g、酵母粉1 g、MgSO41.5 g、KH2PO41 g、维生素B1 10 mg，补充水至1 000 mL)、玉米浆培养基(玉米浆3 g、葡萄糖50 g、豆饼粉10 g、KH2PO41.5 g、MgSO41.5 g，补充水至1 000 mL)3种培养基于22 ℃，转速180 r·min-1下进行振荡培养7 d.培养物进行5 000 r·min-1离心10 min，取菌丝体用PBS缓冲液清洗2～3次后，按照湿质量1 g·mL-1的量加入PBS进行匀浆，12 000 r·min-1离心10 min后取上清液连同发酵液进行纤溶活性的测定.琼脂糖-纤维蛋白平板的制法：取质量分数1%琼脂糖7.5 mL，50水浴保温5 min后，加入凝血酶(100 BP·mL-1) 225 μL，混匀，再进行50 ℃水浴保温5 min后加入7.5 mL纤维蛋白原溶液(3.6 g·L-1)，迅速混匀，倒入平板中.凝固后打孔，加入10 μL样品，于37 ℃温浴18 h后测定纤维蛋白平板上的透明圈的直径大小.

2 结果与分析

2.1蛹虫草的生长环境与外观形态

调查发现，蛹虫草多生长在伏牛山区的山体背阴面，主要分布于针叶与阔叶混交林的地表土层中.发现地点的海拔为500 m左右，方位为北纬33.91°、东经112.48°.本次考察发现的蛹虫草主要寄生在昆虫蛹上，已经长出子座，呈一个或多个分枝.子座通常长3～8 cm，呈棒状，上半部比下半部宽，上半部分呈橘黄色，有毛刺状小突起，子囊壳丰富，基部光滑呈暗橙色(图1).同时发现了僵死的幼虫，虫体布满白色的菌丝，未见长出子座.

A, B, C：野生蛹虫草的生长形态： D：寄生在昆虫蛹体上的蛹虫草.

2.2蛹虫草的形态特征

显微镜下观测蛹虫草的子座，可以看到毛刺状小突起，为子囊壳，呈瓶状或圆锥状，埋生或半埋生于子座组织中，内有子囊，呈蠕虫形圆柱形(图2).每个子囊中有线状子囊孢子，并排排列.

蛹虫草分离菌株ycc-ry-01的菌丝为有隔管状，无色透明.菌落生长初期呈纯白色，细密绒毛状，中央有丘形突起，菌丝紧贴培养基生长，边缘较清晰，见光生长后菌丝逐渐变为黄色，表面及平板背面均可见黄色色素分泌(图2).

根据上述子座特征和菌丝形态，结合《真菌鉴定手册》的检索结果，初步鉴定符合虫草属(Cordyceps)的形态特征.但由于未观察到子囊孢子的形态特征，无法采用形态学特征进行精确鉴定.

2.3蛹虫草的分子鉴定

采用CTAB法提取了野生蛹虫草子座和纯培养后的菌株ycc-ry-01菌丝体基因组DNA，采用通用引物ITS1和ITS4进行扩增ITS序列.两者均获得了的扩增产物，大小在550 bp 左右(图3).根据序列测定结果，两者序列完全一致.经整理后发现ITS1-5.8SrDNA-ITS2序列长度为478 bp，GC含量为56.4%.将获得的ITS序列与GenBank 中已经登录的序列进行BLASTN检索比对，结果显示，与蛹虫草C.militaris序列具有高度相似，同源性高达100%.该结果也说明，不同的蛹虫草菌株间的ITS 序列是相对保守的.根据BLAST检索结果，筛选虫草属相关物种的ITS序列与供试菌株的序列进行系统发育树的构建.结果表明，样品菌株ycc-ry-01与蛹虫草聚于一个分支上，而与其他物种相距较远(图4).

图2 蛹虫草的子囊壳(A)和菌落特征(B、C)

综合形态特征和分子鉴定的结果，说明样品为蛹虫草(Cordycepsmilitaris).

泳道1、3：来源于野生蛹虫草子座；泳道2、4：来源于分离菌株ycc-ry-01.

2.4蛹虫草的人工栽培

采用大米培养基对菌株ycc-ry-01和对照菌株ycc-jzc进行了人工栽培培养.结果发现,接种后7 d左右，白色的菌丝逐渐布满培养基表面；培养到10～15 d左右时菌丝可以覆盖培养料，见光后菌丝体由白色逐渐转为桔黄色.此时增加光照时间，促进菌丝体转色和刺激原基形成.生长至20～25 d时，培养基表明有突起，形成小米粒状的原基，采取适当通风和控制好温度、湿度以及光照时间后，继续培养直至50 d时发现，在同样的培养条件下，分离自野生蛹虫草的菌株ycc-ry-01只能形成原基，不能长出子座，而对照菌株ycc-jzc则顺利长出了子座(图5).

括号内数字表示GenBank的登录号

2.5蛹虫草菌株的纤溶活性

分别对菌株ycc-ry-01和对照菌株ycc-jzc在不同培养基上培养获得的发酵液和菌丝体提取物进行了纤溶活性测定.结果表明，菌株ycc-ry-01和菌株ycc-jzc在玉米浆培养基上培养的菌丝体和发酵液具有明显的纤溶活性，出现了透明圈；菌株ycc-ry-01的活性要比菌株ycc-jzc的高；同时2株菌株的活性对比来看，菌丝体提取物的纤溶活性要高于发酵液的活性.而2株菌株在其他2种供试的培养基上无论是菌丝体提取物还是发酵上清液均无明显的透明圈出现，说明无纤溶活性(图6).

A: 培养好的菌种液体种子； B：接种在大米培养基上生长7 d时长出的白色菌丝；C：培养14 d后转色后的黄色菌丝；D: 蛹虫草的原基形成；E: 正在生长的蛹虫草子座；F: 成熟后收获的蛹虫草子座.

3 讨论

根据相关文献记载，蛹虫草在河南省的商城、新县、罗山、信阳、内乡、西峡等地均有分布[7].本研究报道在河南省汝阳县的伏牛山区发现了蛹虫草的存在，增加了蛹虫草的分布地区.这一自然资源在此地的分布，可能与汝阳县伏牛山区的气候温和，雨量适中，四季分明等北亚热带季风区大陆性特征气候有关.由于伏牛山区的地形复杂，林地众多、植被丰富，适应多种鳞翅目昆虫生长繁衍；落叶腐殖土层厚、营养丰富，这些自然条件为蛹虫草的生长和繁殖提供了有利的条件，同时近年来当地政府加强了封山育林、水土保护，也与生态环境的改善等有密不可分的关系.

人工栽培是充分利用蛹虫草和解决野生蛹虫草来源不足的良好途径.然而在人工培养过程中，影响蛹虫草子座(子实体)形成的因素很多，总的来说可以分成：培养条件与环境因素(外因)、菌株的遗传背景因素(内因)[8].本研究中采用大米培养基对分离的菌株ycc-ry-01进行了人工培养，结果只能形成原基，不能长出子实体，而对照菌株ycc-jzc则顺利长出了子实体，这说明与菌株的遗传背景因素有直接关系.李美娜等[9]对同一标本上分得2个形成子实体能力差异的菌株进行了分子分析，试验发现两者在DNA水平上发生很大的遗传变异，也证实了子座的形成与菌株的遗传背景有直接关系.因此，这一方面的相关研究值得进行深入探索.

A：蛹虫草菌丝体提取物的纤溶活性. 1，5：PBS溶液作为对照； 2，3，4：菌株ycc-jzc分别在黄豆、淀粉、玉米浆培养基上获得菌丝体；6，7，8：菌株ycc-ry-01分别在玉米浆、淀粉、黄豆培养基上获得菌丝体；B：蛹虫草的发酵液的纤溶活性.1，5，9分别为黄豆、淀粉、玉米浆等3种培养基液作为对照；2，3，4：菌株ycc-jzc分别在玉米浆、淀粉、黄豆培养基上获得发酵液；6，7，8：菌株ycc-ry-01分别在玉米浆、淀粉、黄豆培养基上获得发酵液.

血栓性疾病是严重威胁人类健康的恶性疾病之一，溶栓抗栓药物的研发已成为国内外研究的热点.许多研究人员逐渐将目光投向食药用菌来获得安全性高、副作用小、疗效好的天然溶栓药物，并相继在金针菇Flammulinavelutipes、糙皮侧耳Pleurotusostreatus和灰树花Grifolafrondosa等上有所发现[10～13]，而对于蛹虫草的纤溶活性也引起了越来越多学者的重视[11, 14, 15].对菌株ycc-ry-01和ycc-jzc在不同培养基中培养获得的菌丝体和发酵液进行了纤溶活性测定和比较，发现蛹虫草的纤溶活性受培养基成分的影响很大，菌株ycc-ry-01在玉米浆培养基上无论是菌丝体还是发酵液均表现较好的活性，菌丝体的活性高于发酵液的活性，说明蛹虫草的纤溶活性物质受到某些培养基成分的诱导表达，主要存在于胞内，也可以分泌到胞外，因此对这些纤溶活性物质的提取和纯化，以及进一步研究其性质和进行产品开发，可为蛹虫草这一珍稀资源的利用提供基础.

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