细粒棘球绦虫GAPDH蛋白的生物信息学分析及其重组表达纯化和酶活性检测

吴巨龙，王 绚，吕 刚，苏 娟，逯召莲，孙萃萍，景 涛,2

细粒棘球绦虫(Echinococcusgranulosus，Eg，又名单房包虫)病是流行于我国(特别是西北地区)常见的人兽共患寄生虫病，是我国规划防治的五大寄生虫病之一[1]。

目前研究中，人们多采用多价复合疫苗即“鸡尾酒”式疫苗对其进行预防[2]。

甘油醛3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, GAPDH) 是参与糖酵解的一种关键酶。在糖酵解过程中，GAPDH催化3-磷酸甘油醛转变成1, 3-二磷酸甘油酸, 后者作为底物在3-磷酸甘油酸激酶催化下生成3-磷酸甘油酸，同时生成一个ATP[3]。在寄生虫, GAPDH的含量非常丰富[4]。

本研究通过筛选细粒棘球绦虫成虫cDNA质粒文库, 寻找、识别出细粒棘球绦虫GAPDH(EgGAPDH)基因,将其编码区克隆到原核表达质粒pET30a(+)中, 表达出融合蛋白, 并检测其生活学活性，为进一步研究其功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1细粒棘球绦虫成虫cDNA质粒文库、载体和菌株 细粒棘球绦虫成虫全长cDNA质粒文库以及EST序列测序结果，原核表达质粒pET30a(+)和大肠埃希菌DH5α、BL21(DE3)由本实验室保存。

1.1.2主要试剂 限制性内切酶EcoRⅠ和Hind Ⅲ，dNTP，蛋白质Marker，T4 DNA连接酶，Tag酶，质粒抽提试剂盒，DNA胶回收试剂盒购自TaKaRa公司；Ni-NTA层析柱、4 500 bp DNA Marker购自Qiagen公司；IPTG，一磷酸腺苷(AMP)购自北京索莱宝公司；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、3-磷酸甘油醛、二硫苏糖醇(DTT)购自Sigma公司进口分装产品；其余试剂均为国产分析纯。

1.2方法

1.2.1EgGAPDH 生物信息学分析 开放阅读框识别采用ORF Finder软件；理化性质分析采用ProtParam网站；保守结构域的预测采用NCBI的CD-Search工具；用MEGA5.1工具构建进化树；蛋白质的二级结构和三级结构分别采用predictprotein和SWISS-MODEL网站预测。

1.2.2cDNA文库的筛选及目的基因的扩增 细粒棘球绦虫成虫cDNA文库经转化DH5α感受态细胞，蓝白斑筛选白色菌落并扩增培养，提取重组质粒pBlue-EgGAPDH。根据EgGAPDH基因序列，设计1对引物，在每条引物的5′端分别引入EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点及保护性碱基。引物的序列为：

上游：5′-CAGAATTCATGAAGCCCCAGGTC-3′，

下游：5′-CGGAAGCTTTTAATGATCCCTCT-3′，

下划线序列为酶切位点。PCR扩增目的基因序列，用1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物后切胶回收并纯化目的片段。

1.2.3重组表达质粒的构建及鉴定 取纯化好的PCR产物和表达载体pET30a(+)，分别用EcoRⅠ和HindⅢ进行酶切后，在T4连接酶的作用下16 ℃过夜，将连接产物转化到已制备好的感受态菌BL21(DE3)中。用含卡那霉素的LB固体培养基筛选阳性菌株后，提取重组质粒，用限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ酶切鉴定，送上海生工有限公司测序。

1.2.4重组EgGAPDH蛋白的诱导表达、纯化鉴定和蛋白浓度的测定 将重组菌接种于含卡那霉素的LB培养基中，37 ℃，180 r/min摇菌，培养6 h，收集菌液，加入IPTG至终浓度为0.8 mmol/L，20 ℃振荡培养过夜后，12 000 r/min离心10 min，收集菌体沉淀后用15 mL纯水重悬，超声8 min，用Ni-NTA层析柱纯化。通过12%SDS-PAGE检测纯化的蛋白。用Bradford法测定重组蛋白的浓度。

1.2.5EgGAPDH 重组蛋白体外酶活力分析 酶活性测定参照文献[5]所述方法进行。

2 结 果

2.1生物信息学分析结果

2.1.1理化性质的预测 对由cDNA序列推测得到的GAPDH蛋白质序列分析发现，其理论相对分子质量为36 128.3 Da，等电点为8.44。

2.1.2保守结构域预测 该蛋白具有2个保守功能结构域，分别是位于N端(第4-159位)的Rossmann NAD(P)结合功能域和位于C端(第156-314位)行使糖运输和代谢的催化功能域。

2.1.3分子进化树的构建 应用MEGA5.1工具，将细粒棘球绦虫与GenBank上已登录的多房细粒棘球绦虫EmGAPDH(登录号：U19101.1)，猪肉绦虫TsGAPDH(登录号：EF468494.1)，人HsGAPDH (登录号：BC029618.1)，日本血吸虫SjGAPDH(登录号：FN316854.1)，华支睾吸虫CsGAPDH(登录号：DF127286.1)，恶性疟原虫PfGAPDH(登录号：AF030440.1)，刚地弓形虫TgGAPDH(登录号: AF265361.1)，秀丽隐杆线虫CeGAPDH(登录号：X04818.1)，马来丝虫BmGAPDH(登录号：U18137.1)，克氏锥虫TcGAPDH(登录号：X52898.1)，婴儿利什曼原虫LiGAPDH(登录号：XM_001467109.1)等11种动物的GAPDH氨基酸序列进行同源比对分析后，运用MEGA5.1软件构建了系统发生树(图1)。从图中可以看出，细粒棘球绦虫GAPDH与多房棘球绦虫的GAPDH亲缘关系最近，与猪肉绦虫次之，与恶性疟原虫、婴儿利什曼原虫等的亲缘关系较远。

图1EgGAPDH系统发生树(数字代表进化距离)

Fig.1Analysisofphylogeny(thenumberindicateevolutiondistance)

2.1.4二级结构的预测 该蛋白二级结构中，α-螺旋占26.79%，β-折叠占30.36%，环状结构占42.86%。预测该蛋白有4个N-糖基化位点，6个蛋白激酶C磷酸化位点，3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点，1个酪氨酸激酶磷酸化位点，4个N-豆蔻酰化位点，1个甘油醛3-磷酸脱氢酶活性位点。分析蛋白跨膜区，结果表明该蛋白为一个胞质内蛋白。

2.1.5三级结构的预测EgGAPDH的三维结果如图2所示，红色部分为酶的活性位点(aa149-156，序列为ASCTTNCL)，从图2可以看出，EgGAPDH的活性位点是位于蛋白三维结构的表面部分。

图2 EgGAPDH的三维结构预测

2.2EgGAPDH 基因PCR扩增EgGAPDH 基因PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳, 在约1 011 bp处显示1条清晰的条带，见图3。

2.3重组质粒的酶切鉴定 将重组表达质粒用限制性内切酶EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切后，经1.0%琼脂糖凝胶电泳,检测到插入片断大小约1 011 bp, 与目的基因片段相符，见图4。

2.4重组pET30a(+)-EgGAPDH 蛋白表达、分离纯化及浓度测定 收集经IPTG诱导表达过夜的重组菌，超声裂解后进行12%SDS-PAGE分离，上清和沉淀中均有明显的目的蛋白，对上清蛋白采用Ni-NTA柱进行分离纯化。结果如图5所示。重组蛋白的浓度为0.42±0.03 mg/mL。

图3EgGAPDH基因PCR鉴定(1%琼脂糖凝胶电泳)

Fig.3IdentificationoftheamplifiedproductofGAPDHgene(1.0%agrosegelelectrophoresis)

1: Amplified product of GAPDH gene; M: DNA standard marker.

图4pET30a(+)-GAPDH重组体双酶切鉴定(1.0%琼脂糖凝胶电泳)

Fig.4IdentificationoftherecombinantpET30a(+)-GAPDHdigestedwithEcoRⅠandHindⅢ (1.0%agarosegelelectrophoresis)

M: DNA standard marker; 1: Recombinant pET30a(+)-GAPDH digested withEcoRⅠ andHind Ⅲ.

2.5EgGAPDH重组蛋白体外酶活力分析 表1显示, 在重组蛋白EgGAPDH的酶反应体系中, BSA加底物对照组和EgGAPDH未添加底物组均未见酶活,而EgGAPDH加底物组的A340值反应前后明显不同，A340值随重组蛋白EgGAPDH加入量的增多而增高。表明所获重组蛋白EgGAPDH具有酶催化活性。

在低酶量组反应体系的基础上，加入0.5 mL不同浓度的一磷酸腺苷(AMP)，测定其对催化底物转化量NADH的影响。其结果见表2。

如表2结果所示，在所建立的GAPDH反应体系中，未加入一磷酸腺苷(AMP)时体系所测得的吸光度值随反应时间呈持续上升趋势，表明此体系中有反应发生。当加入0.5 mL 0.5 mmol/L的AMP时，体系所测得的吸光度值总体趋势仍上升，但相比第一组明显下降，表明AMP对体系中的反应产生抑制。当加大AMP量至0.5 mL 2 mmol/L时，体系所测定的吸光度值继续下降，表明对反应的抑制作用进一步增强。

表1 重组蛋白EgGAPDH 的酶反应体系吸光度( A340值,

表2 一磷酸腺苷(AMP)对GAPDH酶反应体系光密度值的影响

图5重组pET30a(+)-GAPDH蛋白SDS-PAGE分析

Fig.5SDS-PAGEanalysisofthepET30a(+)-GAPDHprotein

M: Standard molecular weight protein marker;

1: pET30a(+)-EgGAPDH total of sonificated bacterial lysates;

2: pET30a(+)-EgGAPDH supernatant of sonificated bacterial lysates;

3: pET30a(+)-EgGAPDH deposition of sonificated bacterial lysates;

4: The purifiedEgGAPDH.

3 讨 论

GAPDH广泛存在于原核生物和真核生物中，在生物体的糖代谢中有着重要的作用。GAPDH由单一基因编码, 是一个高度保守的基因。GAPDH基因在所有的组织中的表达相对衡量、持续，在分子生物学的研究中，常被用作内参基因[6]。该基因除了在细胞糖酵解过程中产生重要作用外, 还执行不同的生物学功能, 这与GAPDH在亚细胞中的定位有关[7]。分布在细胞膜的GAPDH主要执行内吞功能, 参与大分子的运输。细胞浆中的GAPDH 主要参与糖酵解代谢,产生能量(ATP)，以及通过对转录的调控，控制基因的表达。细胞核内的GAPDH除了通过对转录的调控来控制基因的表达外，还在DNA的复制, 遗传信息的传递，以及DNA的修复以保持基因组的稳定方面发挥作用[8]。

近年来GAPDH对寄生虫的保护性免疫力的研究在国内外受到关注, 多房棘球绦虫GAPDH抗原性和保护性免疫力已被证实[9], 曼氏血吸虫所衍生的42 kD GAPDH物种蛋白可以诱导小鼠产生抗血吸虫尾蚴感染的保护性反应[10]，闫玉涛等学者曾研究日本血吸虫大陆株GAPDH基因核酸疫苗免疫C57BL/6小鼠诱生的免疫应答特征和保护性[11]。此外，GAPDH作为细粒棘球绦虫糖酵解过程的关键酶，是抑制糖酵解过程的潜在靶标，阻断GAPDH的功能可以干扰虫体赖以生存的碳水化合物和能量代谢，从而抑制寄生虫的生长，所以目前GAPDH已成为研发抗寄生虫药物的重要靶标[12]。国外文献报道，AMP及其相似物可以在GAPDH催化3-磷酸甘油醛生成1，3-二磷酸甘油酸的反应过程中对NAD+产生竞争性抑制，并以此来研究相关抗寄生虫的药物[13-18]。因此，对细粒棘球绦虫GAPDH酶及其基因的深入研究，无论对于更全面了解细粒棘球绦虫的生理代谢和致病作用，还是对新的抗细粒棘球绦虫药物的开发研究，都具有重要意义。

本研究首次克隆获得了1 011 bp的细粒棘球绦虫成虫GAPDH基因全长cDNA序列，基于GAPDH基因的cDNA序列推测的蛋白质序列长336个氨基酸。通过同源性分析发现该蛋白质在进化中高度保守。该蛋白包含2个保守区域，一个为NAD(P)结合功能域(aa4-159)，另一个为酶的催化区(aa156-314)，这说明该蛋白可能具有甘油醛3-磷酸脱氢酶相同的作用。

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