鸡致病性大肠杆菌的分离鉴定

王建舫

（北京农学院兽医学（中医药）北京市重点实验室，北京 102206）

鸡致病性大肠杆菌的分离鉴定

王建舫

（北京农学院兽医学（中医药）北京市重点实验室，北京 102206）

无菌采取病死鸡脑、肝脏、脾脏和肾脏接种于麦康凯琼脂平板，分离出特征性的大肠杆菌菌落，经生化和血清型鉴定，鉴定出该分离菌为肠埃希氏菌1型，血清型为O78，但与O92血清型有很高的交叉。药敏试验结果显示：该分离菌株对头孢拉定、头孢噻吩和头孢氨苄有耐药性，而对头孢曲松中度敏感，对卡那霉素、庆大霉素、氨苄西林、氧氟沙星、诺氟沙星和环丙沙星敏感。致病力试验显示：腿部肌肉注射的雏鸡全部死亡，腹腔注射的雏鸡部分死亡，其他鸡只健康存活。

大肠杆菌；血清型；耐药性；致病力

鸡大肠杆菌病是由致病血清型大肠杆菌引起鸡的细菌性传染病，临床上可表现为急性败血症、气囊炎、肝周炎、心包炎、卵黄性腹膜炎、输卵管炎、滑膜炎、眼炎、关节炎、脐炎、肉芽肿以及肺炎等，最常见的是急性败血症和卵黄性腹膜炎[1]。各品种和日龄的鸡均可感染，但是肉仔鸡最易感。为控制大肠杆菌在肉仔鸡群中的传播，本实验室对送检的病、死肉雏鸡进行了病原的分离鉴定，并对分离菌进行了药敏试验和致病力试验，为有效防制该鸡场的大肠杆菌病提供了实验依据。

1 材料与方法

1.1 病料来源

2012年11月河北某肉种鸡场送检的疑似大肠杆菌病的3日龄病死鸡，至送检时已损失7%。

1.2 剖检症状

趾部和头部部分鸡轻微发绀，外观不见明显脱水，肝脏黄棕色，稍肿大，质软，多色彩。脾脏4/6紫红，少血，肾脏4/6出血，脐带部位有出血点。

1.3 细菌分离培养

无菌采取病死鸡的脑、肝脏、脾脏和肾脏，接种于麦康凯琼脂平板，37℃培养18h，然后挑取玫瑰红色、圆形、隆起、光滑湿润边缘整齐的单个菌落分别接种于麦康凯琼脂平板和营养肉汤，37℃培养18h[2]。培养好的麦康凯琼脂平板放于4℃冰箱备用。

1.4 细菌学形态观察

培养好的营养肉汤抹片，革兰氏染色后镜检。

1.5 细菌的鉴定

生化实验由农业部兽医诊断中心用法国梅里埃生化鉴定卡进行。血清型分型由中国兽医药品监察所和本实验室同时进行。

1.6 药敏试验

挑取玫瑰红色、圆形、隆起、光滑湿润边缘整齐的单个菌落接种于营养肉汤，37℃培养。待菌液OD600值达到0.25[3]时，用无菌棉拭子蘸取菌液，于管壁上挤去多余液体，涂布整个MH琼脂表面，反复涂布几次，每次将平面旋转60度，保证涂布均匀。盖上平皿室温下放置5min，使培养基表面的水分吸收掉，用无菌眼科镊子将含卡那霉素、头孢拉定、头孢噻吩、头孢氨苄、头孢曲松、庆大霉素、氨苄西林、氧氟沙星、诺氟沙星和环丙沙星的药敏纸片贴于平皿上，每个平皿贴5种药敏纸片，纸片与纸片中心距离不得小于24mm。纸片贴好后15min内，将平皿倒放在37℃培养箱内，培养20h。结果判断依据《纸片法抗菌药物敏感试验操作标准（第四版）》进行。

1.7 致病力试验

1.7.1 菌液制备

将分离菌接种于3ml营养肉汤，37℃培养3～4h，使其细菌数达到2*108CFU/ml，4℃保存备用。

1.7.2 动物试验

（如下表所示）1日龄健康肉鸡36只，随机分成A、B、C、D四个大组，每个大组又随机分为1、2、3三个小组，其中4个1组按不同的接种途径接种细菌菌液100ul，接种剂量为2*107CFU；同样2组也按不同的接种途径接种细菌菌液100ul，接种剂量为2*106CFU；3组接种100ul灭菌生理盐水作为对照。隔离饲养。死亡鸡只死后立即剖检，未死鸡只6天全部剖检，所有的鸡无菌采取脑、肝脏、脾脏和肾脏，接种于麦康凯琼脂平板，37℃培养18h。

2 结果

2.1 病死鸡的病理剖检变化

外观不见明显脱水，脑内未见明显变化，肝脏黄棕色，稍肿大，质软，多色彩。脾脏4/6紫红，少血，肾脏4/6出血；部分鸡有“三炎”症状。

2.2 细菌分离

在营养琼脂平板上37℃培养18h后，形成中等大小，圆形微凸起，表面光滑湿润，浅灰色半透明大菌落。在麦康凯琼脂平板上7℃培养18h后，形成玫瑰红色、圆形、隆起、光滑湿润边缘整齐的大菌落。

2.3 细菌形态学观察

取病死鸡脑、肝脏、脾脏和肾脏等组织培养物涂片染色镜检，均可见两端钝圆，多数散在排列，偶尔有2～3个连在一起的革兰氏阴性短杆菌。

2.4 细菌鉴定结果

2.4.1 生化试验结果

生化试验结果显示，此次分离的大肠杆菌对硝基-苯-β-D-吡喃半乳糖苷酶、赖氨酸、鸟氨酸、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、蜜二糖、蔗糖、海藻糖、棉子糖、葡萄糖、色氨酸显示阳性，柠檬酸钠、苯丙氨酸盐、丙二酸、七叶灵、阿东醇、纤维二糖、丙酮酸盐、细胞色素氧化酶显示阴性结果。根据法国梅里埃生化鉴定编码册，本实验室分离的细菌符合大肠埃希氏菌1型的特征。

2.4.2 血清型试验

血清型实验结果显示：此次分离的大肠杆菌能够与O78和O92单因子血清进行玻板凝集，试管凝集反应的凝集价分别为640和320，故判断该大肠杆菌的血清型为O78。

2.5 药敏试验

药敏试验结果显示：头孢拉定、头孢噻吩和头孢氨苄没有抑菌圈，该分离菌株对这三种药物有耐药性，而对头孢曲松中度敏感，对卡那霉素、庆大霉素、氨苄西林、氧氟沙星、诺氟沙星和环丙沙星敏感。建议该场慎用头孢类和青霉素类药物，轮换使用卡那霉素和庆大霉素等氨基糖苷类和喹诺酮类药物。

2.6 致病力试验

A1组雏鸡48h内全部死亡，A2组雏鸡在72h内全部死亡，C1组66h有1只死亡，C1组其他雏鸡和其他组雏鸡健康存活。剖检：死亡鸡肝脏黄棕色，稍肿大，质软，多色彩，脾脏紫红，少血，肾脏出血，有“三炎”症状，与发病病死病理变化相似。其他雏鸡没有明显的临床症状。所有的鸡无菌采取脑、肝脏、脾脏和肾脏，接种于麦康凯琼脂平板，37℃培养18h，结果显示：死亡鸡只的组织培养物均长出玫瑰红色、圆形、隆起、光滑湿润边缘整齐的大菌落，未死鸡的组织培养物均未长菌。

3 小结与讨论

（1）致病性大肠杆菌广泛存在于患病鸡，隐性感染鸡的体内和外界环境中，易感鸡群可通过饲料饮水经消化道传播。通风不良、密度过大、应激、环境卫生较差、饲料营养部全及某些疫苗的免疫接种等都可促进本病的发生。该场的种鸡由国外空运而来，进鸡后34h开始发病死亡，但是同一栋的4栏中只有2栏发病，另外2栏未见异常。怀疑是在运输途中由于运输工具消毒不彻底或者该场的器具消毒不彻底造成了致病性大肠杆菌经脐带进入雏鸡体内而发生的感染。

（2）在药敏试验结果的指导下，该场于4日龄应用敏感性药物，9日龄时死亡基本控制住，说明我们的耐药性试验对于生产上临床用药起到了指导作用。

（3）大肠杆菌临床分离菌株通过不同的途径和不同的剂量接种雏鸡，结果显示：在腿部肌肉、口服、腹腔注射和滴鼻四种途径接种途径中，腿部肌肉注射的致病性最强，腹腔注射次之，而口服和滴鼻无可见的致病性症状，也没有分离到接种菌，可能是由于致病菌没有进入机体或者是由于多数细菌从消化道和呼吸道道排除体外，从而使实际进入机体的细菌量大大减少而使机体耐过。

[1] 吴清民.兽医传染病学[M].中国农业大学出版社，2001：156-161.

[2] 曹澍泽.兽医微生物学及免疫学技术[M].北京农业大学出版社，1992.

[3] F.奥斯伯，R.布伦特，R.E.金斯顿等，精编分子生物学实验指南[M].科学出版社，1998：6-7.

2.6 杜绝污染，合理用药

畜禽尿、便等污物要按规定达标后排放，严禁对环境造成污染。对病死畜要按有关规定处理，不得随意丢弃、宰杀或处理。发病时切忌随意用药，以防影响疫病防治效果和畜禽产品质量。

2.7 全面培训，科学饲养

对养殖户要开展技术培训，使他们尽快掌握畜禽饲养管理技术，做到户户科学养殖，从而提高养殖技术水平，扩增养殖小区建设的实效。

2.8 加强管理，完善制度

养殖小区由于养殖密度高，必须加强统一管理并建立相应的制度。如小区人员和物品出入管理制度、兽药、疫苗购进使用登记管理制度等。

在庭院式经营弊端出现后，人们选择了养殖小区，它以“小农户、大群体”的畜牧业新型组织形式出现，进行着畜禽养殖的标准化、规范化生产。而构筑养殖小区的“生物安全”屏障，则是解决畜牧业发展瓶颈问题的重要途径，也是实现动物安全生产及其产品质量安全卫生的必然选择，同时可以加速推进畜牧业规模化、规范化、标准化和安全化生产的进程。