载脂蛋白B基因多态性与激素性股骨头坏死筋脉淤滞证的相关性

曾 平，梁景超，韦向东，韦标方

(1广西中医药大学第一附属医院，南宁530001;2广西中医药大学;3横县人民医院;4临沂市人民医院)

激素性股骨头坏死(SONFH)是骨科临床常见病与疑难病，属于中医“骨蚀”范畴，临床上以筋脉瘀滞证与肝肾亏虚证多见。研究发现，脂代谢紊乱在SONFH的发生发展中起关键作用，而位于ApoB基因外显子的两个位点XbaⅠ(rs693)和EcoRⅠ(rs1042031)的多态性与脂代谢紊乱有关。已有证据表明，载脂蛋白B(ApoB)基因多态性与SONFH关系密切［1，2］，且与中医证型相关［3，4］，而 SONFH 的发病与遗传易感性有关［5］。关于ApoB基因多态性与SONFH遗传易感性的关系目前尚未见报道。为此，我们于2010年1月～2013年12月进行了如下研究。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2010年1月～2013年12月于广西中医药大学第一附属医院、临沂市人民医院及广西横县人民医院住院治疗确诊为SONFH的患者108例，其中男 53例，女 55例，年龄(39.85±10.07)岁;诊断参照《股骨头坏死诊断与治疗的专家建议》［6］，中医辨证分型参照《中药新药临床研究指导原则(试行)》［7］筋脉瘀滞证64例(筋脉瘀滞组)，肝肾亏虚证44例(肝肾亏虚组);使用肾上腺皮质激素的原发病为格林巴利综合征9例，系统性红斑狼疮30例，肾病综合征16例，肾移植手术13例，血小板减少性紫癜17例，皮肤科疾病11例，五官科疾病12例。另选同院经肾上腺皮质激素治疗未发生SONFH的患者98例为对照组，其中男38例，女60例，年龄(41.04±13.61)岁;原发病为格林巴利综合征11例，系统性红斑狼疮25例，肾病综合征15例，肾移植手术18例，血小板减少性紫癜15例，皮肤科疾病6例，五官科疾病8例。三组激素使用均符合以下条件［8］:连续使用;时间不少于6周;3个月内总量不少于2 000 mg强的松(折合后)。三组年龄、性别、原发病资料具有可比性。

1.2 ApoB基因XbaⅠ、EcoRⅠ多态性检测

1.2.1 DNA提取 三组常规禁食12 h后，采集外周静脉血5 mL，EDTA抗凝，DNA提取试剂盒直接提取DNA。应用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA样品质量并估计DNA浓度，稀释样品至工作浓度(5～10 ng/μL)。

1.2.2 DNA测序 135例DNA样品采用直接测序法进行DNA分型，71例DNA样品采用聚合酶链反应—连接酶法(PCR-LDR)进行DNA分型。直接测序: ①PCR扩增:根据目的序列，设计并合成引物进行扩增，PCR扩增体系(25 μL)包括DNA模板1 μL、10 × PCR Buffer(Mg2+free)2.5 μL、MgCl2(50 mM)0.8 μL、dNTP(10 mM)0.5 μL、Primer F 0.5 μL、Primer R 0.5 μL、Platinum Taq(5U)0.2 μL、ddH2O 18 μL;反应条件为94℃预变性5 min，1个循环，94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸60 s，共33个循环，72℃终末延伸5 min，一个循环。PCR-LDR法测序:PCR扩增体系(15 μL)包括DNA模板 1 μL、10 × PCR Buffer(Mg2+free)1.5 μL、dNTP(10 mM)0.3 μL、Primer F 0.25 μL、Primer R 0.25 μL、Platinum Taq(5U)0.25 μL、ddH2O 11.45 μL;反应条件为94℃预变性2 min，一个循环，94℃变性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，共35 个循环，72℃终末延伸3 min，一个循环。PCR扩增产物均用1.5%琼脂糖凝胶、150 V电压下电泳进行检测。采用虾碱酶方法进行PCR产物纯化，用ABI PRISM 3730 DNA Sequencer对产物进行测序。

1.3 统计学方法 采用SPSS19.0软件进行统计分析，Hardy-Weinberg平衡法检验群体代表性。等位基因型和基因频率组间比较采用χ2检验，计量资料用±s表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 遗传平衡检验 Hardy-Weinberg定律检验显示，各组ApoB基因XbaⅠ、EcoRⅠ的基因型和等位基因频率分布差异无统计学意义(P均＞0.05)，符合遗传平衡定律，具有群体代表性。

2.2 ApoB基因XbaⅠ位点基因型及等位基因分布XbaⅠ位点共检测出2种基因型:X-X-和X+X-。其中筋脉瘀滞组 X-X-、X+X-分布频率分别为79.7%(51/64)、20.3%(13/64)，肝肾亏虚组分别为86.4%(38/44)、13.6%(6/44)，对照组分别为93.9%(92/98)、6.1%(6/98);等位基因 X+、X-分布频率筋脉瘀滞组分别为10.2%(13/128)、89.8%(115/128)，肝肾亏虚组分别为 6.8%(6/88)、93.2%(82/88)，对照组分别为 3.1%(6/196)、96.9%(190/196);筋脉瘀滞组X+X-基因型及X+等位基因频率高于肝肾亏虚组及对照组(P均＜0.05);肝肾亏虚组与对照组相比，差异无统计学意义。

2.3 ApoB基因EcoRⅠ位点基因型及等位基因分布 EcoRⅠ位点共检测出2种基因型:E+E+和E+E-。其中筋脉瘀滞组E+E+、E+E-分布频率分别为 85.9%(55/64)、14.1%(9/64)，肝肾亏虚组分别为 90.9%(40/44)、9.1%(4/44)，对照组分别为98.0%(96/98)、2.0%(2/98);等位基因 E+、E-分布频率筋脉瘀滞组分别为93%(119/128)、7%(9/128)，肝肾亏虚组分别为 95.5%(84/88)、4.5%(4/88)，对照组分别为 99.0%(194/196)、1.0%(2/196);筋脉瘀滞组E+E-基因型及E-等位基因频率高于肝肾亏虚组及对照组(P均＜0.05);肝肾亏虚组与对照组相比，差异无统计学意义。

3 讨论

股骨头坏死在传统中医典籍里并没有确切病名，中医学对该病的认识很大程度上基于西医现代医学研究。中医认为，痰瘀是SONFH的病理基础，脂代谢紊乱是引起机体痰瘀发生的主要物质基础。摄入肾上腺皮质激素导致体内膏脂布化失调，痰浊内生，日久痹阻脉道血络。虚实错杂，夹痰夹湿是其证候特点，早期以筋脉瘀滞证常见，晚期以肝肾亏虚证常见，而筋脉瘀滞证贯穿疾病始终［9］。现代基因学说中，基因多态性旨在阐明不同个体对疾病的易感性及耐受性的实质，多基因论点与中医学证型的整体性有着共同特点。因此，研究基因多态性与中医证候的相关性，有助于为阐明“证”的物质基础及中医诊断的客观性标准提供依据［10］。

ApoB是低密度脂蛋白的结构蛋白，在脂质代谢过程中发挥关键作用［11，12］。研究表明，ApoB 基因多态性是引起脂代谢紊乱的重要因素。ApoB基因位于染色体2p24-p23，其中 XbaⅠ(rs693)与 EcoRⅠ(rs1042031)两个位点的基因多态性与股骨头坏死的发生发展密切相关，这主要是由于相关等位基因改变了体内TG、HDL-C水平，导致脂代谢紊乱，而脂代谢紊乱是SONFH的危险因素之一。SONFH是一个多因素疾病［13］，已有证据表明，SONFH的发病与遗传易感性有关［5］，而基因多态性分析显示，部分患者存在促凝血基因［14］、脂质合成基因［15］等异常，从而诱发SONFH。本研究结果显示，筋脉瘀滞组XbaⅠ、EcoRⅠ基因型与等位基因频率分布与肝肾亏虚组及对照组比较差异有统计学意义，而肝肾亏虚组与对照组差异无统计学意义。这提示ApoB基因XbaⅠ、EcoRⅠ位点多态性可能与SONFH筋脉瘀滞证型有一定关系，其中XbaⅠ位点的X+X-基因型、X+等位基因及EcoRⅠ位点的E+E-基因型、E-等位基因可能导致SONFH筋脉瘀滞证的遗传易感性增强。

总之，在基因水平研究SONFH脂代谢相关基因的多态性与中医证候之间的关系，能进一步阐明中医证候的物质基础，为中医临床诊治提供科学依据。但疾病过程中证候的变化具有动态性而基因多态性相对恒定，且当前研究样本量较少，存在个体差异，尚未排除基因与环境相互作用的影响，故仍需进一步深入探讨SONFH的证候变化与相关基因多态性的关系，验证本研究结果。

［1］Hirata T，Fujioka M，Takahashi KA，et al.ApoB C7623T polymorphism predicts risk for steroid-induced osteonecrosis of the femoral head after renal transplantation［J］.J Orthop Sci，2007，12(3):199-206.

［2］韦标方.基因多态性与山东临沂地区激素性股骨头坏死遗传易感性的关联［J］.中国组织工程研究与临床康复，2011，25(39):7403-7405.

［3］曾平，韦标方，何伟，等.激素性股骨头坏死中医证候与载脂蛋白 B 基因多态性的关联［J］.新中医，2010，42(12):24-26.

［4］陈卫衡，张叔钦，琳娜，等.ApoAI、B基因多态性与非创伤性股骨头坏死证候相关性研究［J］.中国中医骨伤科杂志，2010，18(7):1-4.

［5］Hadjigeorgiou G，Dardiotis E，Dardioti M，et al.Genetic association studies in osteonecrosis of the femoral head:mini review of the literature［J］.Skeletal Radiol，2008，37(1):1-7.

［6］李子荣.股骨头坏死诊断与治疗的专家建议［J］.中华骨科杂志，2007，27(2):146-148.

［7］卫生部.中药新药临床研究指导原则［M］.北京:中国医药科技出版社，2002:354.

［8］杨述华.骨坏死学［M］.北京:人民军医出版社，2002:148.

［9］李勇，何伟，张庆文，等.激素性股骨头坏死基因多态性与中医证型的关联性研究［J］.新中医，2012，44(6):87-89.

［10］曾平，韦标方，何伟，等.激素性股骨头坏死遗传易感性的研究进展［J］.中国骨伤，2010，23(2):156-159.

［11］汪晓燕，牛晓红，陈卫衡，等.载脂蛋白 A1、B基因多态性对非创伤性股骨头坏死发生的影响［J］.中国骨伤，2008，21(2):99-102.

［12］Hirata T，Fujioka M，Takahashi KA，et al.ApoB C7623T polymorphism predicts risk for steroid induced osteonecrosis of the femoral head after renal transplantation［J］.J Orthop Sci，2007，12(3):199-206.

［13］何伟，李可大.激素性股骨头坏死的遗传易感性研究［J］.中国骨与关节外科，2009，2(4):284-289.

［14］Bond J，Adams S，Richards S，et al.Polymorphism in the PAI-1(SERPINE1)gene and the risk of osteonecrosis in children with acutelymphoblastic leukemia［J］.Blood，2011，118(9):2632-2633.

［15］Li X，Jin L，Cui Q，et al.Steroid effects on osteogenesis throughmesenchymal cell gene expression［J］.Osteoporos Int，2005，16(1):101-108.