化疗联合树突状细胞回输治疗急性髓细胞白血病的疗效观察

徐 珺，袁国林，吕婷婷，田小龙，黄 莹

(襄阳市中心医院，湖北襄阳441021)

目前，急性白血病(AL)的治疗手段主要是化疗和干细胞移植。随着医学科技迅速发展，虽然一定程度上提高了急性髓细胞白血病(AML)的缓解率，但由于微小残留白血病(MRD)的存在，复发仍是影响患者无病生存的重要因素，因此，最大限度地杀灭残留肿瘤细胞是防止复发的关键。树突状细胞(DC)免疫治疗是其主要的方法，也是目前细胞免疫治疗的热点。为探讨化疗联合DC回输治疗AML的临床疗效，我们进行了相关研究。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2009年11月～2011年11月我院收治的AML患者21例，男11例、女10例，年龄21～70岁、中位年龄42岁，均符合张之南主编的《血液病学》中的 AML诊断标准［1］，M1 3例、M2 15例、M4 2例、M5 1例;均为化疗后获得细胞形态学完全缓解者。将患者随机分为对照组10例，观察组11例，两组临床资料有可比性。

1.2 方法

1.2.1 DC制备及鉴定 观察组签署知情同意书后，用血细胞分离机采集其外周血单个核细胞，经淋巴细胞分离液离心获得单个核细胞，置于37℃、5%CO2培养箱中，培养2 h后洗去非贴壁细胞，将获得单个核细胞中的贴壁细胞调整密度为5×106/mL进行培养。加入粒单细胞集落刺激因子(GM-CSF)1 000 U/mL、白介素 4(IL-4)500 U/mL、TNF-α 500 U/mL，培养单个核细胞分化为成熟DC。培养10 d后，收集悬浮的DC，在光镜下观察其形态结构，采用流式细胞术检测DC表型。取培养的DC行免疫治疗。

1.2.2 治疗方法 两组均行常规化疗，方案如下:①MA方案:米托蒽醌10 mg静滴，第1～3天;阿糖胞苷(AraC)0.1 g静滴，12 h一次，第1～7天。②DA方案:柔红霉素40 mg静滴，第1～3天;AraC 0.1 g静滴，12 h一次，第1 ～7 天;或 AraC 1.0 g静滴，12 h一次，第1～3天。③AA方案:阿克拉霉素40 mg静滴，第1～3天;AraC 0.1 g静滴，12 h一次，第1～7天。④HA方案:高山尖杉酯碱4 mg静滴，第1～3天;AraC 0.1 g静滴，12 h一次，第1～7天。⑤CAG方案:阿霉素10 mg静滴，第1～4天;AraC 0.15 mg静滴，第1～14天。在常规化疗基础上，观察组在患者双颈部、腋下、腹股沟淋巴结区6部位行DC 106个/次皮下注射，2 d一次，6次为一疗程，间歇2个月后治疗第2个疗程。

1.2.3 评价方法 依照张之南主编的《血液病学》中的疗效评价标准，疗效指标包括持续缓解率、复发率、中位生存时间。采用流式细胞仪检测MRD细胞。

1.2.4 统计学方法 采用 SPSS17.0统计软件，计量数据以±s表示，组间比较用t检验;计数资料用百分比表示，组间比较用χ2检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DC形态 在倒置显微镜下，成熟DC贴壁生长，细胞体积增大，大小不等。培养初可见多数圆形贴壁细胞，加入GM-CSF、IL-4 48 h后，悬浮细胞增多;72 h后大量细胞集落，细胞数增多，体积增大，细胞表面伸出毛刺样突起;第5天多数细胞重新贴壁;第6天悬浮细胞增多，细胞聚集，表面突起增多;加入TNF-α后第7～8天集落分散，细胞悬浮生长，分布较均匀，大小为成熟单核细胞的1.0～1.5倍，可见典型的树枝样突起。电镜下见细胞表面大量褶皱和粗细不等的树枝样突起;透射电镜下见细胞形态不规则，表面伸出多级突起，细胞核清晰，细胞质内线粒体丰富，粗面内质网发达，可见溶酶体。

2.2 DC表型鉴定 体外培养10 d后的DC表型为CD83+(67±4)%，HLA-DR+(75±6)%，CD11c(62±8)%，提示DC成熟。

2.3 两组疗效比较 观察组11例共接受DC治疗44次，其中1例8次、2例6次、8例3次。DC治疗后，持续缓解7例(64%)、复发4例(36%)，中位生存时间18个月。对照组10例治疗6个疗程后，持续缓解2例(20%)、复发8例(80%)，中位生存时间9个月。两组持续缓解率、复发率及中位生存时间比较P均＜0.05。

2.4 两组MRD细胞比较 观察组治疗后MRD细胞＜10-4个，对照组 MRD细胞10-2～10-4个，两组比较 P ＜0.05。

2.5 不良反应 观察组皮下注射DC顺利，无反应，除3例轻微发热(体温37.8℃，自行降至正常)、2例全身疼痛(对症处理后2 d缓解)外，未见其他不良反应。

3 讨论

自20世纪60年代以来，随着抗肿瘤新药的应用，明显改善了AL患者的近、远期疗效。但经化疗后到临床及血液学完全缓解，体内仍有106～108个MRD细胞，其成为白血病缓解期短、复发快的主要原因。研究发现［2］，在完全缓解的AL患者中，80%因MRD复发影响长期生存。因此，化疗后MRD细胞是复发的主要根源，治疗MRD成为降低复发亟待解决的难题。近年研究发现，细胞免疫治疗在消除MRD细胞、降低复发率、提高患者总生存率方面具有重要地位。

研究发现，恶性肿瘤患者免疫力低下，缺乏强有力的抗肿瘤免疫应答，肿瘤抗原不能有效地提呈给淋巴细胞，是造成肿瘤细胞逃逸、增生活跃的原因［3］。DC是目前公认的体内功能最强大的专职性抗原提呈细胞，其能激活静息型T细胞，主要参与细胞免疫及T细胞依赖性体液免疫反应，在抗白血病细胞免疫应答中起重要作用。来源于外周血单核细胞的DC称为mDC，主要表达CD33、HLA-DR和CD11c;来源于浆细胞样的DC称为pDC，主要表达HLA-DR和 CD123。研究表明，mDC通过合成和分泌IL-12促使静息Th细胞向Th1细胞分化，引发Th1反应，启动Th1细胞分泌IL-12，进一步促进Th1细胞分泌干扰素γ，以增强细胞毒T细胞的功能，在肿瘤免疫效应中发挥关键作用［4］。研究发现，完全缓解的AML患者存在DC功能低下。国内外学者对AML患者骨髓中DC亚群的定量分析显示，其mDC功能和数量降低［5～8］。AL的发生、发展与机体免疫功能失调密切相关，免疫系统无法识别和清除恶变和突变的细胞，致使肿瘤细胞逃逸机体免疫系统的监视和清除;另外，化疗无法及时清除恶性肿瘤综合治疗后的MRD细胞，最终需动员机体的免疫功能方可达到其作用［9］。我们前期的研究发现［10］，完全缓解 AML 患者行 G-CSF、GM-CSF 治疗后，其DC活性升高，促淋巴细胞的增殖能力增强，且偏向mDC生长。本研究显示，观察组用G-CSF、GM-CS治疗后，DC高表达 CD83、HLA-DR和CD11c，主要为mDC细胞;与对照组比较，其持续缓解率高、中位生存时间长、复发率低。

研究表明，MRD能早期判断患者体内的残留白血病细胞，预测其复发率，早于临床预测复发3～6个月［2］。本研究发现，观察组行DC治疗后的MRD细胞比率明显低于化疗后，且其MRD细胞＜10-4个的比率明显高于对照组，说明DC治疗可明显清除MRD细胞。提示DC治疗具有抗肿瘤细胞作用，可在一定程度上减少疾病的复发。本研究结果与国内外相关报道一致［11～13］。

综上所述，DC治疗能明显清除完全缓解AML患者的残留白血病细胞，预防复发，值得临床推广应用。

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