FISH技术对自然流产患者胎盘绒毛染色体数目的检测结果分析

厉吉霞，王延桂，夏西燕，李曙晨，吴海霞，庄学伟

(1烟台市烟台山医院，山东烟台264001;2济南护理职业学院; 3山东大学齐鲁医院)

自然流产为常见疾病，发病原因较多，其中染色体异常尤其是数目异常引起者占50%以上［1］。荧光原位杂交(FISH)技术是一种具有高度灵敏性和特异性的染色体和基因分析技术，可选择的标本范围广泛(包括胎盘绒毛、羊水、脐血、孕妇外周血及宫颈冲洗液)，目前广泛用于染色体异常的产前诊断，并逐步发展到植入前遗传学诊断。2011年8月～2014年1月，我们应用FISH技术对45例不明原因流产患者进行了13/16/18/21/22/X/Y染色体数目异常检测，旨在为分析自然流产原因提供依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 同期收治的不明原因自然流产者42例，年龄23～37岁(平均28岁)，妊娠时间6～20+6周。其中首次流产29例、复发性流产13例(2次流产9例、3次以上流产4例)。42例均留取胎盘绒毛组织待检。

1.2 染色体数目检测 采用13/16/18/21/22/X/Y染色体数目检测试剂盒 GLP13/GLP21、GLP16/ GLP22、CSP18/CSPX/CSPY。具体步骤:①玻片制备:检测标本以生理盐水洗净后剪碎，置于5 mL浓度为0.075 mmol/L的KCl低渗溶液中，37℃水浴20 min;缓慢加入固定液2 mL，吹打混匀后1 500 r/ min离心10 min，去上清后再重复2次，离心后去上清，于沉淀物中加1～2 mL冰醋酸，消化1 min后制备成细胞悬液滴片，于56℃老化玻片2 h以上。②玻片预处理及变性杂交:室温下，将玻片于2×SSC溶液中漂洗5 min，37℃下于0.08 mg/mL胃蛋白酶中消化5 min，再于2×SSC溶液中漂洗5 min，依次在70%、85%、100%的梯度乙醇中脱水各3 min，干燥;探针在杂交仪共变性(75℃，5 min)，杂交(42℃，16 h)。③玻片洗涤:2×SSC溶液中洗涤10 min，转入0.1%的NP-40洗涤5 min，用70%乙醇洗涤3 min。④复染:用联咪二苯吲哚(DAPI)复染。⑤结果判读:每组探针计数100个细胞，正常细胞＞90%提示指标正常、异常细胞＞60%提示指标异常，介于两者之间者加大计数再判定。

1.3 统计学方法 采用简明统计(CS14.0)软件进行数据处理。率的比较行χ2检验，P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

42例中18例(42.85%)检测出染色体数目异常，其中三体型异常8例(19.04%)，包括13三体1例(2.38%)、16三体5例(11.90%)、22三体2例(4.76%)，未见18三体及21三体;三倍体异常3例(7.14%);四倍体异常2例(4.76%);单倍体异常5例(11.91%)，其中X单体4例、21单体1例。首次流产和复发性流产者中分别有11例(37.93%)、7例(53.85%)检测出染色体数目异常，两者比较，P＜0.05(χ2=5.153)。

3 讨论

FISH技术为新兴的分子细胞遗传学技术，其原理是利用荧光标记的DNA探针与被检测样本中DNA碱基对的互补性，在探针与样本DNA杂交后，通过荧光显微镜检测荧光信号发现细胞、组织样本中的染色体或基因异常。FISH技术的优点是可在获得羊水24 h内(无需培养)得到关于13、18、21、X、Y的染色体数目信息。此外，该技术对于样本的要求比较低，对羊水量少、羊水活细胞数目少、孕周偏大、细胞培养失败、核型结果难以判读等各种原因导致核型分析失败者均可进行针对性弥补检测。因此，FISH技术拓展了细胞遗传学的检测范围、提高了细胞遗传学识别异常的能力，可弥补核型检测失败的缺陷。

怀孕早期自然流产者中有50%～60%存在染色体异常［1～5］，主要是染色体数目异常(染色体结构异常者＜5%)，其中16三体是最为常见的染色体数目异常类型［6，9］，13、14、15、18、21、22三体较少，1、5、9三体仅有个例报道［6～8］。本研究显示，42例中染色体数目异常者占42.85%，与文献［2，5］报道的43.33%～44.40%基本相符;国外也有报道在53%～54%，考虑与样本取材及样本量有关。在人类常染色体中，除13号染色体外，其他染色体均存在三体型病例;染色体多态性研究表明，约75%的常染色体三体源于女性第一次减数分裂不分离的染色体，而三体型异常最多见的是16三体，其次是22、21、15、14三体。本研究显示，染色体数目异常以三体型最多(占19.04%)，其中16三体比例最高，与文献报道相符。说明染色体非整倍体畸变是导致胚胎流产的主要原因之一。三倍体的每号染色体均为3条，约80%为双精子受精，少数是二倍体卵子或二倍体精子受精，其胚胎有69XXX、69XXY、69XYY三种核型，大多数生长缓慢，一般在孕15周前流产，本组发生率为7.14%。单倍体异常指细胞染色体总数为45，缺少的染色体主要见于性染色体，目前所知的惟一常染色体单体是21单体;45，X核型是自然流产中较常见的染色体异常(10%～20%)，本组占8.89%;四倍体一般少见，由合子早期有丝分裂失败所致，胚胎常在早期流产，本组发生率为4.76%，比例最低。此与文献［5］报道相符。

有关流产次数与胚胎染色体异常发生率关系的研究［9～11］结论不一。本研究显示，复发性流产者染色体数目异常率显著高于首次流产者。提示自然流产的次数与胚胎染色体数目异常可能有关。染色体结构异常是染色体断裂和重排的结果，一般比例＜5%［1，3］。本研究所使用的探针不具有基因定位功能，但如选择合适的探针可实现对染色体结构异常的诊断。因此。FISH技术虽是常规核型分析技术的必要补充，但不可能完全代替常规染色体核型分析，其还有待于进一步发展和完善。

综上所述，自然流产者胎盘绒毛染色体数目异常率较高(尤以复发性流产者为著)，FISH技术检测染色体数目有助于某些疾病的产前诊断。

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