莽草酸的制备及其生物学功能研究进展

何邵平，禹琪芳，段杰林，肖定福，贺建华*

（1.湖南农业大学动物科学技术学院，长沙 410128；2.中国科学院亚热带农业生态研究所，长沙 410125）

莽草酸又名毒八角酸，是一种具有天然生物活性的含手性碳化合物[1]。是自然界中存在的一种重要有机酸，也是植物代谢过程的中间产物，在木兰科八角属植物茴香（Illicium verum）的果实中含量较高。

现代药理学研究证明，莽草酸及其衍生物具有抗菌、抗肿瘤、抗血栓及脑缺血、抗炎、抗病毒等多种生物活性。目前我国在临床上将该化合物鉴定为合成治疗H5N1亚型高致病性禽流感唯一有效药物“达菲”的关键中间体，这使得莽草酸的开发价值大幅提高[2]。对于禽流感发生频率的增多，其作为合成抗禽流感药“达菲”的主要原料，具有广阔的研究前景。本文结合国内外研究进展从莽草酸的来源、提取分离纯化工艺、制备途径、生物学功能等进行详细阐述。

1 莽草酸的理化性质及主要植物性来源

莽草酸是一种白色粉末晶体，分子式C7H10O5，相对分子质量为174.15，化学结构为3，4，5-三羟基-1-环己烯-1-羧酸，熔点为185～187℃，难溶于氯仿、苯和石油醚等有机溶剂，易溶于水，在水中的溶解度为180 g·L-1。由于分子结构中含3个羟基，一个羧基，一个双键，因而莽草酸可以成酯，也可以成盐。莽草酸是一种重要的生物代谢中间体，可以作为许多生物碱、芳香氨基酸以及吲哚衍生物等合成原料[3]。莽草酸是由Eykman在1885年首次从八角科植物的干燥成熟果实中提取得到，随后Sieb和Zucc将其命名为Shikimic acid[4]。研究发现，莽草酸广泛存在于各种植物组织中，如银杏科植物银杏叶和内皮、桃金娘科植物柠檬桉的树叶、使君子科植物诃子的果实和树叶、伞形科植物茴香的茎和叶、桑科无花果的果实、八角茴香的果实。其中以八角茴香中莽草酸的含量最高（约10%）[5]。

2 莽草酸的制备方法

2.1 从植物中提取

莽草酸是高等植物经莽草酸代谢途径的产物，因而很多高等植物都能生产莽草酸，只是量不同而已，能提取分离莽草酸的植物有八角茴香、金丝桃、毒箭木、小饭团、山海螺、枫香、鸡蛋参、马尾松松针等[6]。根据莽草酸的溶解性质以及现代提取分离新技术大量的运用，建立了许多莽草酸的提取方法包括常规溶剂提取、超声波辅助提取、微波辅助萃取、膜分离法提取、分子印迹技术提取等。

谢济远等采用水蒸汽蒸馏法提取了湿地松松针中挥发油和莽草酸，用高效液相色谱仪测定提取物中莽草酸的含量，通过单因素实验和正交实验，确定水蒸汽蒸馏法提取莽草酸最佳工艺条件是：松针粒度为40目、料液比为1∶12、浸泡时间为6 h、提取时间为4 h，莽草酸的得率（提取液中莽草酸质量/八角茴香质量）为1.32%[7]。林於等通过采用水提醇沉、大孔吸附树脂脱色、离子交换树脂分离等方法，从马尾松中分离纯化莽草酸，所得莽草酸含量高达96%，得率为0.78%[8]。Xie等用乙醇浸提湿地松松针中的莽草酸，研究不同水平乙醇浓度、料液比、浸提温度、提取时间及浸泡时间对莽草酸提取率的影响，通过单因素和正交实验，确定影响莽草酸提取率的因素主次顺序是：乙醇浓度＞提取温度＞料液比＞提取时间；乙醇浸提法提取莽草酸的最佳工艺为：乙醇浓度为60%，提取温度为75℃，料液比为1∶25，提取时间为2.5 h，在该条件下，莽草酸的得率为1.49%[9]。逯家辉等也通过采用响应面法优化超声波提取方法，从八角茴香中提取莽草酸的得率验证值为8.21%，与预测值的相对误差为0.45%[10]。同样刘洁等利用超声波方法，通过单因素试验采用二次回归通用旋转组合设计试验方法建立数学模型，提取率（提取液中莽草酸质量/八角茴香中莽草酸总质量）达99.3%，满足生产需要，并得出了提取莽草酸的优化工艺为：时间46min，温度83℃，液料比12∶1，粒度60目，重复两次[11]。林海禄等也利用超声波提取法与传统提取作了比较，超声提取40min，得率为2.89%；热回流提取180min，得率为2.38%[12]。姚菁华等为优化八角茴香中莽草酸的微波提取工艺研究各自变量及其交互作用对莽草酸提取的影响，采用响应面分析软件，模拟得到二次多项式回归方程的预测模型，在其条件下，平均得率为3.03%[13]。林海禄等与丁雷涛等也都采用微波辅助分别从八角茴香和松针中提取了预期量的莽草酸[14-15]。此外，周媛媛等利用分子印迹技术（莽草酸模板分子∶丙烯酰胺功能单体∶乙二醇二甲基丙烯酸酯交联剂=1∶8∶8），以偶氮二异丁腈为引发剂，合成莽草酸分子印迹聚合物（MIPs）其效果最佳[16]。根据莽草酸吸附等温线，印迹效果非常明显，MIP吸附容量是非分子印迹（NIP）3.76倍，可用于提取莽草酸。因此，提取莽草酸时，传统的分离方法具有提取效果差、收率低等缺点。而超声波提取具有收率较高、生产周期短，有效成分基本不被破坏等优点；微波辅助提取法具有设备简单、操作时间短、适用范围广、重现性好、溶剂消耗量少，且提取率较高、速度快、污染小等一系列优点，对提取天然产物有效成分具有广阔应用前景；MIPs由于具有显著的选择性吸附能力，现被广泛的应用于各种分离过程中，因此，采用分子印迹技术研制莽草酸特异性选择性分子印迹聚合物有重要的应用价值。

2.2 化学合成

20世纪以前，莽草酸及其衍生物的合成方法主要有：碳氢化合物转化法、奎宁酸转化法、Diels.Alder反应和逆Diels.Alder反应[17]。碳氢化合物转化法主要以手性碳结构单元（1R，5R，7S）-7-[（二甲基叔丁基硅氧基）甲基]-6，8-二氧二环[3.2.1]辛-3-烯-2-酮和乙烯溴化镁经过一系列氧化还原反应，最后水解生成莽草酸，莽草酸总收率可达7.8%。奎宁酸转化法则是以奎宁酸衍生物和2，2-二甲基丙烷作为原料合成，总收率达62%[5]。而逆Diels.Alder合成法以环戊二烯和苯醌为原料，初始合成莽草酸，总收率最高可达41%（碳源为基础）。之后在许多学者相继发表有关非手性有机原料代替莽草酸来合成达菲的方法[18-19]。

2.3 微生物代谢合成

目前，利用工程菌发酵生产莽草酸的研究多是采用基因工程改造的大肠埃希菌。通过中止莽草酸循环中产生莽草酸下游途径，从而达到莽草酸积累的目的。大肠埃希菌具有两个莽草酸激酶，分别为aroK编码的莽草酸激酶Ⅰ和aroL编码的莽草酸激酶Ⅱ。试验发现，aroL编码的莽草酸激酶Ⅰ的Km比莽草酸激酶Ⅱ的大约100倍。只有当底物莽草酸达到一定浓度后，激酶Ⅰ才具有生物活性，因此，在大肠埃希菌中催化此反应中激酶Ⅱ起主要作用[20]。Fu等通过敲除aroL基因，其突变株能够有效积累莽草酸提高产量157%[21]。李明明等利用Red-Xer重组系统连续删除了野生型大肠杆菌CICIM B0013的莽草酸激酶基因（aroL、aroK），葡萄糖磷酸转移酶系统（PTS）的关键组分EIICBglc的编码基因（ptsG）以及奎宁酸/莽草酸脱氢酶基因（ydiB），发酵结果表明，4个基因缺失的大肠杆菌代谢工程菌生产莽草酸的能力比原始菌提高了90多倍[22]。汪华等与陈凯等也进行了相关报道，得到了类似的结论[23-24]。

2.4 其他合成途径

Bresnahan等研究表明，除草剂草甘膦能干扰莽草酸的正常代谢途径，主要是由于草甘膦被小麦吸收后被转移到植物的活性生长区内，通过抑制5-烯醇丙酮酸-莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS）合成，而发挥作用[25]。有研究表明，EPSPS是色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等蛋白质合成的关键酶，由于EPSPS的合成被抑制，因而导致莽草酸的大量积累。

不同途径获得的莽草酸各有不同的特点。从植物中提取莽草酸是目前主要来源之一，但是主要提取植物八角茴香受到地域限制，生产资源有限，不是今后发展主要渠道。因此，合适的化学合成途径和生物代谢合成途径将成为发展重点。另外，在以往的报道中只有某一途径获得的莽草酸具有生物学功效，对不同途径获得的莽草酸效价对比性研究几乎很少，有待进一步研究。

3 莽草酸的生物学功能

3.1 抗菌、抗肿瘤

研究表明，莽草酸衍生物具有抗菌、抗肿瘤作用。以莽草酸甲酯为底物合成的乙二醛酶Ⅰ抑制剂类似物对海拉细胞株和埃希利腹水癌具有明显抑制作用，且能延长接种白血病细胞L1210小鼠的存活时间，而对机体自身的毒性相对较低，其抑制机理可能与硫氢化物的反应有关。孙快麟等也得到了类似的结果，并证实莽草酸衍生物二霉素的类似物，与二霉素有着类似的体外抑制白血病细胞L1210的功能[26]。

3.2 抗血栓形成

莽草酸对心血管系统的保护作用主要是通过抑制血小板聚集和抗血栓的形成。马怡等报道表明，莽草酸具有显著抗血栓作用以及抑制动、静脉血栓及脑血栓的形成，通过进一步研究发现，莽草酸主要是通过影响花生四烯酸代谢，抑制血小板聚集和凝血系统，进而发挥其抗血栓形成的作用[27]。王宏涛等也得到类似结论，研究发现，异亚丙基莽草酸（ISA）具有显著抑制血栓形成功能，这可能与其抗血小板聚集作用有关[28]。陈骁熠等采用体外给药法观察马尾松中的莽草酸对Collagen和ADP诱导的血小板聚集的影响，结果可见，马尾松中的莽草酸有很好的抑制体外Collagen、ADP诱导的血小板聚集，且剂量和作用呈现一定的正相关性[29]。这说明马尾松中莽草酸能抑制血小板聚集，具有抗凝血作用，可防止血栓形成。

3.3 抗脑缺血

莽草酸及其衍生物抗脑缺血的功能主要通过抑制血小板聚集和血栓形成以及抑制血管内皮细胞的活化，从而发挥抗脑缺血的作用。马怡等探讨莽草酸对中脑动脉形成血栓后病灶脑缺血影响结果表明，其能够显著减少小鼠中脑动脉血栓的形成[27]。钟兆忠等研究表明，三乙酰莽草酸（TSA）通过降低脑缺血后的红细胞聚集程度以及抑制血小板聚集，从而促进脑血液微循环，另外，TSA还可影响P-选择素的表达，抑制脑缺血再灌注和凝血酶引起的血小板与中性粒细胞的黏附，从而发挥其抗脑缺血的功能[30]。王宏涛等在研究ISA对大脑中动脉栓塞模型大鼠脑组织自由基代谢作用时发现，ISA能显著提高脑组织中SOD和GSH-px的活力，显著降低了MAD的水平，提示ISA可能是通过减少自由基对脑组织损伤而达到保护脑组织缺血性损伤作用[28]。

3.4 抗炎镇痛

邢建峰等研究发现，ISA不仅可以抑制炎症早期的渗和水肿，也可抑制炎症晚期的组织增生以及肉芽组织的形成，具有显著的抗炎症功能。另外ISA能够影响细胞转录因子STAT1、STAT3、NF-kB的表达[31]。ISA通过下调转录因子NF-kB的活性，抑制炎症因子（IL-1β、TNF-α、INF-γ）的表达，从而起到抗炎症的效果[32]。莽草酸具有一定的镇痛作用，其主要通过影响动物的神经中枢，从而达到抑制效果，具体检测指标为动物扭体的频率。林洁等采用扭体法和温浴法试验发现，腹腔注射莽草酸溶液能显著减少小鼠扭体次数，这表明莽草酸对小鼠具有明显的镇痛作用[36]。

3.5 抗禽流感作用

瑞士罗氏公司生产的神经氨酸酶抑制剂“达菲”，对抗流感病毒具有显著抑制作用，试验研究表明，其对禽流感病毒H5N1和H9N2具有显著的抑制作用，而莽草酸是合成“达菲”的重要原料[34]。其作用机理为莽草酸结构中的亲脂性基团与流感病毒的神经氨酸酶的疏水部分结合，使病毒的神经氨酸酶失去分解被污染细胞表面唾液酸的能力，阻断了病毒颗粒向周围细胞的扩散，从而抑制流感病毒的继续传播。

4 展 望

莽草酸是一种比较有前景的新型天然药物，其来源广泛。莽草酸作为合成抗禽流感药“达菲”的重要原料，也受到许多学者的关注，因此寻找高产率、低成本的制备途径是所有研究者努力的方向。目前，对莽草酸及其衍生物等的研究主要集中在抗血栓、抗炎、抗病毒方面，而对于其抗肿瘤作用以及机制的研究鲜为报道。因此，在莽草酸抗肿瘤及其分子水平作用机制方面可以更为深入的研究，对其进行很好的开发利用，为社会做出更大的贡献。此外，如果将莽草酸作为一种添加剂适用于家畜生产的有效性需进一步研究。

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