董 颖,张翼宙
(浙江中医药大学第一临床医学院,浙江杭州310053)
中药丹参味苦性微寒,归肝经,具有活血祛瘀、软坚消癥之功效,临床常常用于治疗心脑血管疾病和肝纤维化。《本草纲目》谓其“能破宿血,补新血”。《本草便读》曰:“丹参,功同四物,能祛瘀以生新,善疗风而散结,性平和而走血。”肝纤维化是指由各种致病因子所致肝内结缔组织异常增生,导致肝内弥漫性细胞外基质(extracellular matrix,ECM)过度沉淀,从而致使肝脏结构和功能异常改变的一种病理过程,是各种慢性肝病向肝硬化发展所共有的病理改变和必经途径。目前认为肝纤维化的形成是由各种肝损因子引起肝细胞损伤、坏死、凋亡及肝组织炎症反应,激活枯否细胞分泌多种细胞因子,与肝细胞、血小板及窦内皮细胞分泌的细胞因子、脂质过氧化物等化学递质,共同作用于肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC),并激活转变为肌成纤维细胞发生表型及功能改变,通过旁分泌或自分泌机制,使肌成纤维细胞增殖,合成大量的胶原和蛋白多糖等ECM。HSC的激活并转化为肌成纤维细胞是肝纤维化发生、发展的中心环节[1]。现代药理学研究证实,丹参具有扩张血管,降低胆固醇、血脂,抑制凝血,激活纤溶等作用[2]。近年来随着研究的进一步深入,对丹参的有效成分及对相关疾病的作用机制有了更加深入的认识,现就丹参有效成分抗肝纤维化的分子机制进行综述,以期为丹参的进一步研究和开发提供依据。
丹参有效成分主要有两类:脂溶性的二萜醌类和水溶性的酚酸类。脂溶性成分主要有丹参酮类二萜和罗列酮类二萜,以前者含量较高。丹参酮类化合物有丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、丹参酮ⅡB、隐丹参酮等,其中最主要的脂溶性成分为丹参酮ⅡA,其含量约为药材的0.1%~0.9%。丹参酮类成分在生物体内的代谢产物常参与机体的多种生物化学反应,具有改善血流循环、抑制血小板聚集、提高耐缺氧能力、改善冠状动脉供血等药理作用[3]。丹参水溶性成分主要有原儿茶醛、丹参素、丹酚酸A和B、迷迭香酸等,具有抗氧化、抗凝、抗血栓、抗心肌缺血及调血脂等作用。相关药理实验证明,丹参素是丹参中最有效的活性成分[4],丹酚酸A和丹酚酸B的抗心肌缺血与抗缺氧的活性较强[5],丹酚酸B的含量较丹酚酸A高,为丹参水溶性成分中最主要的活性成分[6]。
随着研究的深入,丹参单体IH764-3作为丹参的一种水溶性活性提取成分,其在抗肝纤维化方面的作用也得到更广泛的证实[7]。因此,本文主要就丹参酮ⅡA、丹参素、丹酚酸A、丹酚酸B和丹参单体IH764-3的抗肝纤维化作用机制进行综述。
丹参酮ⅡA分子式为C19H18O3,分子量为294,桔红色针状结晶,易溶于乙醇、丙酮、乙醚、苯等有机溶剂,微溶于水,是天然的抗氧化剂。
当氧应激时,HSC内H2O2迅速升高,成为TGF-β信号传递分子,激活并维持转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)自分泌环,并最终使HSC活化,细胞中胶原生成增加。陈连剑等[8]实验证实丹参酮ⅡA各治疗组能不同程度降低HSC中H2O2浓度,不同程度扭转模型组谷胱甘肽(glutathione,GSH)水平和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)的活力,从而通过抑制脂质过氧化来抑制HSC的增殖和活化。孙瑞芳等[9]实验提示丹参酮ⅡA可能通过阻止TGF-β1/Smad3信号通路,降低IGFBP7表达的机制而起到抗肝纤维化和逆转肝纤维化的作用。覃筱燕等[10]证实,丹参酮ⅡA可明显减少肝纤维化大鼠肝组织TGF-β1和α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)阳性表达的细胞数,从而减少HSC的活化,抑制ECM的合成,达到抗肝纤维化的作用。研究表明在HSCs活化过程中,其胞质内的Ca2+是许多生长因子、细胞因子及氧化应激产物等发挥促生长和增殖作用的主要递质之一,实验显示丹参酮ⅡA药物血清可显著抑制HSCs内钙的升高,提示丹参酮ⅡA可能通过抑制HSC内Ca2+的升高,从而抑制HSCs的活化与增殖[11]。
丹参素是丹参的水溶性各种成分的基本结构,其结构为3,4-二羟基苯乳酸,分子式为C9H10O5,分子量为198,白色长针状结晶。
吴宗辉等[12]观察了丹参素对鼠HSCs内c-Jun氨基末端蛋白激酶(c-Jun N-terminal protein kinase,JNK)和核转录因子(nuclear factor-κB,NF-κB)信号通路的抑制作用,发现丹参素能抑制HSCs的活性和增殖,增加HSCs的凋亡率,减少Ⅲ型胶原的合成和分泌,能明显抑制白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)刺激的 HSCs中 JNK、P-IκB-α 的磷酸化和 NF-κB的表达,其机制可能是丹参素能够抑制JNK和NF-κB的信号转导。李冬等[13]的体外实验同样证实丹参素可以抑制IL-1β诱导的HSC的增殖,促其凋亡,减少胶原的生成,其机制与抑制NF-κB活性有关,在保护肝细胞增加损伤肝脏的自我修复的同时,减少肝星状细胞的增殖,促其凋亡,减少炎性因子及胶原生成,减少肝纤维化的促发因素,从正反两方面发挥持久的抗肝纤维化作用。余斌斌[14]发现丹参素可抑制正常传代培养的和经IL-1β刺激的大鼠HSC增殖、Ⅰ型胶原合成与分泌。戴晴等[15-16]均通过实验观察了丹参素对TGF-β1诱导活化的大鼠肝星状细胞增殖的影响,发现丹参素能下调HSCs细胞膜上TβRI、Ⅱ蛋白的表达,抑制了HSCs的活化增殖;丹参素能上调HSCs内Smad7 mRNA表达,并下调Smad2、Smad3 mRNA 表达,同时可以抑制 TGF-β1的下游细胞因子结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)而减少 HSCs表达 α-SMA,从而抑制HSCs活化,并抑制TGF-β1诱导的HSCs活化。呙琳琳等[17]实验得出丹参素可通过抑制血小板衍生生长因子BB(platelet derived growth factor-BB,PDGF-BB)诱导的HSC增殖和活化,同时抑制与肝纤维化密切相关的促分裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinases,MAPK)、磷脂酰肌醇(-3)激酶[phosphatidylinositol(-3)kinase,PI3K]途径中ERK、AKT蛋白的磷酸化,负性调控肝纤维化过程,其机制可能与抑制细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular signal regulated protein kinase,ERK)和 PI3K 信号转导通路有关。
丹酚酸A分子式为C26H22O10,分子量为494,淡黄色结晶,可溶于乙醇、乙醚,大量研究证实其有良好的抗氧化与抗肝纤维化作用。
经丹酚酸A作用后,肝细胞培养上清液中ALT、AST活性及肝细胞丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量降低,该肝细胞条件培养液对HSC的增殖作用也显著降低,Ⅰ型胶原合成和mRNA表达量同时减少,作用强于维生素E,说明丹酚酸A通过抗肝细胞脂质过氧化损伤,抑制HSC活化的旁分泌激活途径而发挥抗肝纤维化作用。丹酚酸A可抑制体外培养的大鼠HSC增殖、Ⅰ型胶原分泌与沉积,抑制前胶原α2(I)mRNA表达,提示丹酚酸A对HSC活化功能有直接抑制作用[18]。体内实验发现,丹酚酸A可降低CCl4慢性中毒大鼠血清ALT、AST活性和肝组织MDA含量,从整体实验证实丹酚酸A有显著的抗脂质过氧化肝损伤作用;另一方面,丹酚酸A可降低肝脏羟脯氨酸(hydroxyproline,Hyp)含量,减轻肝组织纤维化程度,抑制肝脏Ⅰ、Ⅲ型胶原沉积,有显著抗肝纤维化作用;并且Hyp和MDA含量呈正相关,证实丹酚酸A抗脂质过氧化作用与其抗肝纤维化作用密切相关[19]。胡义扬等[20]发现,丹酚酸 A可降低CCl4损伤大鼠肝组织Ⅰ型胶原mRNA表达量,提示丹参能在基因转录水平上调节胶原代谢。
丹酚酸B分子式为C36H30O16,分子量为718,类白色粉末,味微苦、涩,具引湿性,可溶于水、乙醇、甲醇。
实验研究表明丹酚酸B能够提高肝脏组织胞质内NF-κB和NF-κB抑制蛋白(inhibitor of NF-κB,IκB)的表达,降低胞核内 NF-κB 蛋白的表达来抑制肝纤维化的进程[21]。刘建国等[22]实验得出 CCl4诱导的肝纤维化模型大鼠肝功能、肝纤维化程度、血清内毒素水平、血浆TNF-α含量及CD14mRNA和蛋白的表达较对照组显著增加,丹酚酸B治疗组与模型组比较上述指标均降低,表明丹酚酸B抗肝纤维化的作用机制可能与其能下调肝组织CD14的表达、阻滞内毒素信号转导通路有关,从而抑制肝脏炎症及减少肌成纤维细胞的增殖等。薛冬英等[23]从分子生物学角度证明了丹酚酸B抑制TGF-β1诱导的HSC内ERK信号传导通路,对PDGF在HSC内的信号传导通路的抑制作用在于抑制了HSC上PDGF受体的表达,从而揭示了丹酚酸B通过下调HSC内TGF-β和PDGF信号传导,阻止HSC增殖活化、分泌ECM的抗肝纤维化作用机制。陶艳艳等[24]以NIH/3T3成纤维细胞株为细胞模型,观察了丹酚酸B对TGF-β1刺激3T3成纤维细胞内TGF-β1/ERK信号转导途径,尤其是TGF-β1受体表达以及EPK磷酸化水平的影响。结果表明丹酚酸B剂量依赖性抑制TGF-β1型受体(TβR-1)的蛋白表达,抑制 EPK 磷酸化与PAI-1蛋白表达。由此,作者提出丹酚酸B抑制TGF-β1胞内ERK信号转导,拮抗TGF-β1的促NIH/3T3成纤维细胞胶原生成可能是丹酚酸B抗肝纤维化的作用机制之一。
丹参单体IH 764-3是丹参的一种水溶性活性提取成分,分子量为158。
刘丽等[25]通过观察不同剂量IH764-3干预H2O2刺激的HSCs得出:丹参单体IH764-3能够抑制HSCs增殖及胶原合成的作用与FAK介导的信号转导通路有关,通过减少H2O2刺激的FAK mRNA表达是IH764-3抑制HSCs增殖及胶原合成的机制之一。房澍名等[26]应用 IH764-3干预 HSCs后,明显降低了HSCs ERK1蛋白、mRNA的表达水平,并随着IH764-3浓度的增加ERK1蛋白、mRNA的降低亦越明显,且显著低于单纯H2O2干预组。王占魁等[27]实验证实,丹参单体IH764-3可以通过抑制TGF-β1下调TIMP-1表达,且不同剂量的IH764-3使HSCs表达TIMP-1呈剂量依赖性减少,从而达到防治肝纤维化的目的。张晓岚等[28]通过动物模型及体外细胞培养,探讨丹参单体IH764-3对HSCs增殖与凋亡的影响,结果显示凋亡的HSCs显著增加,α-SMA表达明显减少,肝组织磷酸化FAK、ERK蛋白表达显著下调。王春生等[29]实验显示丹参单体IH764-3可能通过上调MT1-MMP和MMP-2的表达,下调TIMP-2的表达在抑制总胶原和Ⅰ型胶原的合成同时促进其降解,进而延缓肝纤维化进程。赵东强等[30]证实IH764-3抑制HSC增殖并促进其凋亡细胞增殖受cAMP/cGMP调控,cAMP升高或(和)cGMP降低可抑制细胞增殖,实验发现IH764-3促进HSC内cAMP,并可降低细胞钙调蛋白水平,提示IH764-3抑制HSC增殖的机制在于影响细胞内cAMP与钙调蛋白[31]。
综上所述,丹参各有效成分可以通过以下几种途径:①降低 TGF-β1、TNF-α、PDGF 等细胞分子的表达;②阻滞钙离子通道;③干预 JNK、NF-κB、ERK、内毒素等细胞内信号转导通路,从而抑制HSC的活化,最终达到抗肝纤维化的目的。但是由于肝纤维化发病机制有一定的复杂性,而丹参又具有多成分、多环节、多靶向的作用特点,因此丹参各有效成分在发挥肝纤维化的作用机制时存在一定的重叠性。另一方面来说,各有效成分相互作用也可能出现另一种作用效果,若能明确各成分间相互作用的叠加性必能对丹参抗肝纤维化提供新的思路。近年来,血管新生与肝纤维化的关系成为新的热点,新生血管形成在肝纤维化发生、发展过程中起重要作用。在慢性肝病的过程中,新生血管有关的黏附分子、血管内皮细胞生长因子(vessel endothelial cell factor,VECF)、整合素和血管生成素等表达增加,同时可伴有明显的血管新生[32],而相关文献表明,血管新生是在原有血管基础上芽生出新的血管,广泛参与慢性炎症、损伤修复、局部缺血和免疫紊乱等病理生理过程[33],这与中医中的“血瘀证”所反映的病理过程与变化极其相似。因此,作为活血化瘀类的代表药物,若能通过相关研究表明丹参及其有效成分能够在血管新生的过程中发挥相应的抑制作用,必然能为中药开发和抗纤维化防治提供更广阔的前景,对于临床实践有着深远的意义。
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