P16蛋白在宫颈上皮内病变及宫颈癌中的表达及意义

魏 璇 张一兵 杜 雪 马雪梅 杜秀英

子宫颈癌(cervix carcinoma,CC)是女性生殖系统中最常见的恶性肿瘤之一，病死率已跃居各类妇科恶性肿瘤之首[1]。本研究采用免疫组化法监测P16蛋白在宫颈上皮内病变、子宫颈癌组织中的表达，以确定其能否作为检测宫颈癌的生物标志物，以提高宫颈癌的筛查和诊断。

1 材料与方法

1.1 标本来源

收集我院2009年1月-2010年6月宫颈癌石蜡标本65例(其中活检标本31例，手术标本34例),宫颈上皮内病变CIN组90例(其中CINⅠ30例，CINⅡ30例，CINⅢ 30例)作为实验组。同时，随机选取同期因良性病变行全子宫切除的正常宫颈组织30例作为对照组。入选病例既往均无放疗、化疗及激素治疗史。

1.2 主要试剂和方法

P16抗体、SP试剂盒、DAB试剂盒购自北京中杉生物技术有限公司。采用S-P法，免疫组织化学方法参照试剂盒说明进行，以PBS代替一抗作为阴性对照，以已知阳性切片作为阳性对照。

1.3 免疫组化结果判定

P16以肿瘤细胞质或细胞膜呈棕黄色为阳性表达。根据肿瘤细胞阳性数进行判断，采用高倍视野随机记数500个肿瘤细胞中的阳性细胞所占比例，分为4级，≤5%为阴性(-)，6%～25%为轻度阳性(+)，阳性细胞数占26%～75%为中度阳性(++),>75%以上为强阳性(+++)。

1.4 统计学处理

应用SPSS 16.0统计软件,实验数据采用卡方(χ2)检验及Fisher确切概率计算法，以检验水准α=0.05，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 宫颈组织中P16的表达

宫颈癌中 P16阳性细胞弥漫型或呈灶状分布,呈粗大颗粒状,着色深，呈阳性表达。从正常组织、CIN到宫颈组织癌变过程中，P16蛋白表达逐渐增强，阳性细胞逐渐增多并出现于子宫颈上皮全层，染色范围与病变细胞呈明显正相关。在正常对照组、CIN组、宫颈癌组中P16阳性表达率分别为6.7%(2/30)、70.0%(63/90)、100.0%(65/65)；统计学分析差异具有统计学意义(χ2=85.596，P<0.001)。

2.2 P16在CIN组各级别及宫颈癌组中的表达

P16在CINⅠ组、CINⅡ组、CINⅢ组、宫颈癌组的阳性表达率分别为40.0%(12/30)、76.7%(23/30)、93.3%(28/30)、100.0%(65/65)；CIN各组组间相比，CIN各组与宫颈癌组相比差异均有统计学意义(χ2=54.664，P<0.001)。

3 讨论

宫颈癌严重危害妇女身心健康，其发病机制比较复杂，是多因素参与的多步骤的复杂过程，是从非典型增生、CIN、原位癌再到浸润癌的渐进过程。研究表明[2]，CIN Ⅰ级发展到CIN Ⅲ级的平均时间为9年，再发展到浸润性癌则需要3个月到2年，宫颈癌5年存活率为67%，宫颈上皮内瘤样变存活率为100%，故宫颈癌的早期筛查和诊断是降低发生的关键。

在宫颈癌演变过程中，抑癌基因表达失活和癌基因的表达激活是其细胞癌变的分子基础，在已发现的数个抑癌基因中，P16基因与宫颈癌的关系密切[3]。P16基因是与细胞周期密切相关的抑癌基因，编码蛋白可与细胞周期蛋白D竞争性结合细胞周期依赖性激酶CDK4/6，干扰CDK4/6与细胞周期蛋白D的结合，阻止细胞从G1期发展至S期，抑制细胞增殖，防止恶性变。有研究显示许多恶性肿瘤存在P16基因表达异常[4]。但P16在宫颈癌的表达比较复杂，江涛等[5]用免疫组织化学方法研究了102例宫颈组织，其中30例正常宫颈组织中P16蛋白基本为阴性，CIN和宫颈癌组织中P16蛋白的阳性表达率分别为30%和63.5%，Bleotu等[6]研究也证实了这一结果。本实验显示在正常宫颈组织向CIN、宫颈癌演变过程中，随着宫颈病变级别的升高，P16蛋白的阳性表达率逐渐升高，在正常对照组、CIN组、宫颈癌组分别为6.7%(2/30)、70.0%(63/90)、100.0%(65/65)，提示P16的异常表达在宫颈癌的发生发展中发挥重要作用。

P16在宫颈癌中表达增加的原因可能与HPV感染有关[7]，因为宫颈癌患者多伴有HPV感染，HPV病毒表达E7蛋白，E7蛋白与pRb蛋白结合并使之失活，而失活的Rb基因可以反馈性刺激P16表达水平升高。Munoz等在对高危型HPV感染的宫颈癌研究中发现，P16表达与HPVl6/18表达呈正相关[7]，说明P16的过表达是继发于HPV表达的，提示P16蛋白表达异常是肿瘤发生的早期事件。

综上所述，P16可作为宫颈上皮的非肿瘤性增生和肿瘤性增生鉴别诊断的标志物。P16蛋白水平对诊断宫颈高度病变有较高的敏感性和特异性。研究结果亦提示P16蛋白检测可以预测宫颈病变的生物学潜能及其发展的临床结果，可用于宫颈高度病变的筛查。

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[5] 江 涛，李隆玉，潘 玫，等.p16在宫颈癌组织中的表达及其意义〔J〕.实用癌症杂志，2005，20(6)：581-587.

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[7] Munoz N，Bosch FX，de Sanjose S，et al.Epidemiologic classification of human papillonlavirus types associated with cervical cancer〔J〕.N Engl J Med，2003，348(6)：518-527.