磷酸肌酸钠对离体大鼠肝脏ALT/LDH指标的影响

苑晓烨 王淼 曹经琳 曾强 窦剑

肝脏移植是治疗终末期肝病的最为有效的方法。但移植术后相关并发症一直以来困扰着移植医生。有研究证实，移植术后并发症的发生在一定程度上与肝移植供体保存期间组织缺血缺氧及移植后再灌注损伤密切相关［1－5］。目前低温缺血保存仍是普遍使用的供肝保存方法，且几乎都采用UW液保存。有实验证实，在离体肾脏UW液中添加多种非灌注液中常规存在的药物，可对器官的保存产生积极的影响，延长保持时限，同时明显改善移植后肾脏功能恢复［4］。磷酸肌酸(creatine phosphate，CP)是一种高能磷酸化合物，是体内高能磷酸基的暂时贮存形式。通过肌酸激酶的作用，可以供给ADP磷酸基以维持正常的ATP水平。而ATP是任何细胞代谢过程中最主要的能量源。本研究应用含不同浓度磷酸肌酸钠的UW灌注液对离体大鼠肝脏灌注后进行冷保存，检测冷保存期间不同时间点离体大鼠肝脏ALT/LDH指标变化，分析其意义并探索合适的磷酸肌酸钠应用剂量。

1 材料与方法

1.1 材料 选用Wister系雄性大鼠40只，随机分为对照组(单纯UW液灌注肝脏)10只;低剂量组(以UW液为基液加入磷酸肌酸钠，浓度为1 g/100 ml灌注肝脏)10只;中剂量组(以UW液为基液加入磷酸肌酸钠，浓度为2 g/100 ml灌注肝脏)10只;高剂量组(以UW液为基液加入磷酸肌酸钠，浓度为3 g/100 ml灌注肝脏)10只。动物实验方法符合动物伦理学要求。

1.2 试剂 UW液购自百时美施贵宝公司，HCA液(离体肾保存用枸橼酸盐嘌呤溶液)购自上海长征医院注射用磷酸肌酸钠购自海口奇力制药有限公司，乳酸脱氢酶(LDH)测试盒及谷丙转氨酶(ALT)测试盒购自南京建成生物工程研究所

1.3 方法 动物模型制备:采用大鼠肝脏单纯冷保存离体灌注模型，大鼠术前采用10%水合氯醛以0.3 ml/100 g经腹腔麻醉，取腹部“十”字形切口进入腹腔，分离腹主动脉，经腹主动脉插管，灌注4℃HCA液20 ml，经门静脉插管，对照组灌注单纯4℃UW液，实验组分别根据组别灌注以4℃含不同浓度磷酸肌酸钠的UW液，行供肝原位低压重力灌洗(灌洗量20 ml)，同时剪开大鼠心脏建立流出道，灌注至肝脏颜色变淡呈均匀土黄色完整切取肝脏，实验组供肝置于与灌注肝脏所用的相同浓度含磷酸肌酸钠的4℃的UW液中，对照组供肝为4℃单纯UW液保存。指标测定:取由肝下下腔静脉留取的保存液样本，经最佳取样摸索及标准曲线画定后，采用比色法，应用可见光分光光度计测定各样本的吸光度值(OD值)，根据计算公式计算ALT及LDH活性。

1.4 统计学分析 应用SPSS 13.0统计软件，计量资料以表示，计量资料之间比较采用单因素方差分析;Mann-Whitney U检验比较两样本频数资料，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ALT不同时间点4组含量 肝下下腔静脉内的保存液中ALT不同时间点4组含量，与对照组比较，实验组肝脏经过12 h冷保存后肝下下腔静脉内的保存液中ALT含量均小于对照组(P＜0.05)，但高剂量组在经过24 h冷保存后，保存液中ALT含量大于对照组及中剂量、低剂量组(P＜0.05)。见表1。

表1 4组不同时间点ALT含量比较n=，U/L，±s

表1 4组不同时间点ALT含量比较n=，U/L，±s

注:与对照组比较，*P ＜0.05;与低剂量组比较，#P ＜0.05;与中剂量组比较，△P ＜0.05

组别0 h 6 h 12 h 18 h 24 h对照组 46.52 ±1.52 53.05 ±2.68 63.66 ±3.15 64.48 ±1.31 73.81 ± 2.01低剂量组 45.66 ±2.25 51.58 ±1.52 58.49 ±1.85* 64.89 ±3.57 71.25 ±2.29中剂量组 45.29 ±2.09 51.72 ±1.65 58.52 ±1.79* 65.47 ±2.23 71.65 ±1.78高剂量组 46.09 ±1.57 52.45 ±1.55 58.93 ±3.26* 66.18 ±4.38 75.65 ±5.06*#△

2.2 LDH不同时间点4组含量 肝下下腔静脉内的保存液中LDH不同时间点各组含量，与对照组比较，实验组肝脏经过12 h冷保存后肝下下腔静脉内的保存液中LDH含量均小于对照组(P＜0.05)。余各组之间差异无统计学意义(P＞0.05)。见表2。

表2 4组不同时间点LDH含量n=10，U/L，±s

表2 4组不同时间点LDH含量n=10，U/L，±s

注:与对照组比较，*P ＜0.05

组别0 h 6 h 12 h 18 h 24 h对照组 1 640.59 ±102.44 1 916.30 ±93.56 2 272.07 ±102.58 2 548.53 ±107.59 2 809.29 ±99.17低剂量组 1 653.37 ±115.06 1 889.75 ±84.37 2 164.77 ±86.01* 2 458.22 ±147.13 2 735.09 ±95.86中剂量组 1 590.96 ±108.71 1 883.55 ±102.69 2 171.52 ±87.47* 2 433.56 ±131.21 2 767.16 ±164.61高剂量组 1 663.63 ±86.82 1 997.20 ±104.45 2 173.95 ±60.18*2 500.76 ±70.30 2 779.28 ±62.23

3 讨论

肝移植术后并发症的发病因素较为复杂。研究证实，其与供肝保存期间组织缺血缺氧及移植后再灌注损伤密切相关［1－3］。缺血/再灌注损伤涉及许多复杂级联反应的病理生理过程。其中包括中性粒细胞、血小板、细胞因子、活性氧、活性氮、凝血系统以及谷胱甘肽还原酶等因素的激活。最终引起细胞损伤、死亡、组织坏死最终导致多器官功能不全。

CP是一种高能磷酸化合物，体内高能磷酸基的暂时贮存形式，是人体重要的能量供应源。CP可明显改善微循环供血，为细胞的有氧氧化提供能量［5］。外源性CP能被机体组织迅速吸收，直接释放高能磷酸键合成ATP，迅速补充机体能量，保护细胞结构，稳定细胞膜，增加缺氧组织对氧的利用，减轻缺氧组织的损伤［6］心脏外科中应用外源性CP作为能量基质加入心脏停搏液中灌注心肌，能使缺血心肌细胞内能量得到补充，线粒体及细胞膜功能得到维护，避免无氧代谢的损害，从而加强心脏停搏液对心肌细胞的保护作用。

ALT及LDH是检测肝功能的常用指标，肝细胞坏死时ALT升高，其升高的程度与肝细胞受损的程度相一致，因此是目前最常用的肝功能指标。LDH是广泛存在的催化乳酸和丙酮酸相互转换的一种糖酵解酶。LDH存在于机体所有组织细胞的胞质内，几乎存在于所有组织中。本实验结果显示，肝下下腔静脉内的保存液中随着冷保存时间延长，各组ALT、LDH含量逐渐增加，在6～12 h期间，对照组较各实验组 ALT、LDH含量增加明显，以12 h时间点差别最为明显，与对照组比较，实验组肝脏经过12 h冷保存后肝下下腔静脉内的保存液中ALT、LDH含量均小于对照组(P＜0.05)。分析其原因可能因实验组添加了磷酸肌酸钠以提供冷保存期间的能量，增加内源性超氧化物歧化酶活性，有效清除氧自由基，减低肝组织脂质过氧化反应有关。但在保存时间终点即24 h时，高剂量组中ALT含量明显高于对照组以及其他实验组。高剂量组考虑该结果与药物浓度过大，因此增加了长时间冷保存的肝脏组织破坏有关。

在目前各移植中心，多种因素导致供肝无法短时间内移植入受体。其中包括供体的运输时间、移植患者因某些因素未充分完成术前准备、手术摘除病肝困难等。因此，延长供肝保存时限，减少供肝组织缺血损伤，降低供肝血流开放后的缺血再灌注损伤，成为亟待解决的问题。本实验表明，磷酸肌酸钠对离体肝脏冷保存有较好的保护作用，其保护移植肝脏的机制可能与减轻能量代谢障碍，降低氧自由基损伤两个方面作用有关，从而减轻了肝细胞膜脂质过氧化损伤，稳定细胞膜，减轻再灌注时的肝脏损伤。尤其对于经过12 h冷保存后的肝脏具有有效的保护作用，但无法延长最终即24 h冷保存后肝脏的质量。通过本实验研究结果提示磷酸肌酸在供肝保存中可能有较好的应用前景，但本研究尚处于动物试验阶段，将其应用于临床供肝的保存以及成人供肝灌注及保存液中磷酸肌酸钠的用药浓度还有待于进一步研究。

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6 桂静，陈莹，李永凤，等.磷酸肌酸钠对缺氧幼鼠脑组织中钙调蛋白一氧化氮水平的影响.郑州大学学报医学版2012，47:63-66.