硒化卡拉胶寡糖的制备及其抑制血管生成作用研究

吴海歌

(大连大学生命科学与技术学院，辽宁 大连 116622)

硒是生命活动的必需元素[1]，在人类防癌、抗癌、延缓衰老、提高机体免疫力、预防治疗心血管疾病、治疗克山病和大骨节病等方面都发挥了重要作用[2-4]。硒的存在形式有无机硒和有机硒两种，常见的无机硒有亚硒酸钠和硒酸钠等，其活性和毒性范围较窄，生理活性低、毒性大，并具有蓄积性毒性和致突变作用，使用时剂量难以控制。而有机硒具有毒性低、副作用小的特性，能够更好地发挥硒的多种生理活性。有机硒主要包括硒多糖、硒氨基酸、硒蛋白和硒核酸等，其中硒多糖不但具有有机硒的多种活性，而且还具有多糖的各种生理功能，并且硒多糖的活性普遍高于硒和多糖，也更利于被机体吸收利用[5]。因此，近年来对硒多糖的研究已经成为一个热点。

1　实验

1.1　材料与试剂

卡拉胶，江苏常航胶体科技有限公司；人脐静脉内皮细胞，ATCC公司；四甲基偶氮唑蓝(MTT)，Sigma公司；小牛血清，杭州四季青公司；RPMI-1640培养液，GibcoBRL公司。

其它试剂均为国产分析纯。

1.2　方法

1.2.1硒化卡拉胶寡糖的制备

在酸性条件下，将亚硒酸钠、硫酸与卡拉胶进行反应；反应结束后，反应液减压浓缩并通过截留分子量为500的透析袋透析48 h，再经乙醇沉淀、冷冻干燥，得纯化的硒化卡拉胶寡糖。设计正交实验对硒化反应的条件进行优化，以提高产物中的硒含量。

1.2.2硒化卡拉胶寡糖硒含量的测定

采用原子吸收法[9]测定硒化卡拉胶寡糖硒含量。称取50 mg硒化卡拉胶寡糖样品，用1%HNO3溶解，加入1 mL Ni(OAc)2基体改良剂，然后用1%HNO3定容至10 mL(样品浓度为5 mg·mL-1)。分别取样品溶液及标准溶液各2 mL，用原子吸收分光光度计测定样品溶液的硒浓度。硒化卡拉胶寡糖硒含量为所测样品溶液的硒浓度/样品浓度。

1.2.3硒化卡拉胶寡糖的薄层分析(TLC)

对硒化卡拉胶寡糖、乳糖和卡拉胶进行薄层分析，展开剂为正丁醇-乙酸-H2O(体积比为2∶2∶1)。显色剂为苯胺、二苯胺、磷酸和丙酮。

1.2.4硒化卡拉胶寡糖的紫外光谱分析

将微量的亚硒酸钠、卡拉胶、卡拉胶寡糖和硒化卡拉胶寡糖溶于水中，在紫外光谱仪上进行测定。

1.2.5硒化卡拉胶寡糖对鸡胚尿囊膜血管生成的抑制作用

鸡胚尿囊膜实验参照文献[10]进行。将受精的鸡蛋在37 ℃湿润环境下孵育6 d，第7 d后用75%的乙醇将鸡蛋气室端消毒后，小心开启1 cm2的小孔，分别将蘸满50μg·mL-1、100μg·mL-1、200μg·mL-1硒化卡拉胶寡糖或PBS溶液(阴性对照)的明胶放置在气孔中的鸡胚尿囊膜上，封好小孔，继续培养48 h后，在解剖镜下观察鸡胚尿囊膜血管生成情况。

1.2.6硒化卡拉胶寡糖对人脐静脉血管内皮细胞迁移的影响

采用划痕实验检测硒化卡拉胶寡糖对血管内皮细胞迁移的影响。首先在培养板中接种2×105个人脐静脉血管内皮细胞，在37 ℃、5%CO2的条件下培养，待细胞长成密集单层后，以0.5 mm的橡皮刮划过细胞单层，用PBS溶液冲洗2遍，分别加入硒化卡拉胶寡糖和PBS溶液(阴性对照)，硒化卡拉胶寡糖的终浓度分别为50μg·mL-1、100μg·mL-1和200μg·mL-1，继续培养24 h后，显微镜下观察人脐静脉血管内皮细胞迁移的效果。

1.2.7硒化卡拉胶寡糖对人脐静脉血管内皮细胞分化成管的影响

人脐静脉血管内皮细胞分化成管实验参照文献[11]进行并适当改进。首先将5 mg·mL-1的胶原铺到96孔板底，在37 ℃下放置20 min后每孔接种2×104个人脐静脉血管内皮细胞，分别加入PBS溶液(阴性对照)和终浓度分别为50μg·mL-1、100μg·mL-1和200μg·mL-1的硒化卡拉胶寡糖，继续培养24 h后，显微镜下观察人脐静脉血管内皮细胞成管的状态。

2　结果与讨论

2.1　硒化卡拉胶寡糖的制备与表征

在酸性条件下，卡拉胶不仅能够与亚硒酸钠发生反应生成硒化卡拉胶，而且能够通过酸性水解作用最终形成硒化卡拉胶寡糖。纯化后的硒化卡拉胶寡糖为粉色粉末状固体，易溶于水，不溶于乙醇、丙酮等有机溶剂。首次制得的硒化卡拉胶寡糖硒含量为21μg·mg-1，经正交实验优化反应条件后制得的硒化卡拉胶寡糖硒含量达到30μg·mg-1，平均分子量为1.43 kDa。

乳糖、硒化卡拉胶寡糖和卡拉胶的薄层层析结果如图1所示，卡拉胶、卡拉胶寡糖、亚硒酸钠、硒化卡拉胶寡糖的紫外光谱见图2。

图1　乳糖(a)、硒化卡拉胶寡糖(b)、卡拉胶(c)的薄层层析结果

图2　卡拉胶(a)、卡拉胶寡糖(b)、 亚硒酸钠(c)、硒化卡拉胶寡糖(d)的紫外光谱

由图1可以看出，硒化卡拉胶寡糖在硅胶板上的迁移率介于乳糖和卡拉胶之间，并且更接近乳糖，说明制备的产物为寡糖。

由图2可以看出，卡拉胶和卡拉胶寡糖在190～300 nm都没有紫外吸收峰，亚硒酸钠在200～210 nm之间有明显的吸收峰，硒化卡拉胶寡糖与亚硒酸钠在相同波长处出现明显的吸收峰，说明亚硒酸根已经连接到卡拉胶寡糖上，确证产物为硒化卡拉胶寡糖。

2.2　硒化卡拉胶寡糖对鸡胚尿囊膜血管生成的抑制作用(图3)

a.阴性对照b～d.硒化卡拉胶寡糖浓度(μg·mL-1):50,100,200

图3硒化卡拉胶寡糖对鸡胚尿囊膜血管生成的抑制作用

Fig.3Anti-angiogenicactivityofseleno-carrageenanoligosaccharideonchickenchorioallantoicmembrane

鸡胚尿囊膜是检验药物抑制血管生成的经典实验模型。由图3a可以看出，鸡胚在孵化过程中生出正常的树枝状血管；以不同浓度硒化卡拉胶寡糖处理后发现，硒化卡拉胶寡糖能够明显抑制鸡胚尿囊膜的血管生成，在施药部位没有发现大的血管生成;50μg·mL-1和100μg·mL-1剂量组施药部位隐约可见一些微小的血管(图3b、3c)，而200μg·mL-1剂量组施药部位没有发现微小的血管，表明硒化卡拉胶寡糖在50～200μg·mL-1的浓度范围内抑制鸡胚尿囊膜血管生成作用与浓度正相关。

2.3　硒化卡拉胶寡糖对人脐静脉血管内皮细胞迁移的影响(图4)

a.血管内皮细胞划痕后　b.阴性对照　c～e.硒化卡拉胶寡糖浓度(μg·mL-1)∶50，100，200

血管内皮细胞的迁移是血管生成的关键生理步骤之一，抑制血管内皮细胞的迁移是抑制血管生成的有效靶点之一[12]。由图4b可以看出，人脐静脉血管内皮细胞的迁移作用很强，24 h后划痕几乎愈合；由图4c、4d、4e可以看出，不同浓度的硒化卡拉胶寡糖能够抑制血管内皮细胞的迁移，在50～200μg·mL-1浓度范围内，抑制作用与浓度正相关，浓度越高抑制作用越强。抑制血管内皮细胞的迁移能够有效地抑制血管的生成，暗示了硒化卡拉胶寡糖能够通过抑制血管内皮细胞迁移而抑制血管的生成。

2.4　硒化卡拉胶寡糖对人脐静脉血管内皮细胞分化成管的影响(图5)

a.阴性对照　b～d.硒化卡拉胶寡糖浓度(μg·mL-1)∶50，100，200

血管内皮细胞分化成管状结构是决定血管生成的关键因素之一，如果血管内皮细胞不能分化为管状结构，那么新生血管将不能正常形成[12]。由图5a可以看出，在胶原上三维立体培养可以显著诱导人脐静脉血管内皮细胞分化，细胞形成很长的伪足，伪足之间相互联系形成管状的结构；由图5b、5c、5d可以看出，经50μg·mL-1硒化卡拉胶寡糖处理后，人脐静脉血管内皮细胞伸出的伪足变少、变短，成管现象减弱；经100μg·mL-1和200μg·mL-1硒化卡拉胶寡糖处理后，人脐静脉血管内皮细胞变成长梭形或椭圆形，几乎看不到较长的伪足。表明硒化卡拉胶寡糖具有抑制人脐静脉血管内皮细胞分化成管的作用，在50～200μg·mL-1范围内，抑制作用与浓度正相关，浓度越高抑制作用越强。暗示了硒化卡拉胶寡糖能够通过抑制血管内皮细胞分化而抑制血管的生成。

3　结论

在酸性条件下，以亚硒酸钠与卡拉胶反应制备硒化卡拉胶寡糖，硒含量达到30μg·mg-1。鸡胚尿囊膜实验发现，硒化卡拉胶寡糖具有抑制血管生成作用；人脐静脉血管内皮划痕实验和分化成管实验发现，硒化卡拉胶寡糖能够明显地抑制人脐静脉血管内皮细胞的迁移和分化，而且这种抑制作用在50～200μg·mL-1的范围内与浓度正相关，浓度越高抑制作用越强。暗示硒化卡拉胶寡糖可能是通过抑制血管内皮细胞的迁移和分化从而抑制血管的生成。血管生成对肿瘤的生长和转移具有重要的作用，抑制肿瘤血管生成可以有效地抑制肿瘤生长和转移[7-8]，硒化卡拉胶寡糖表现出良好的血管生成抑制作用，预示其在肿瘤血管生成抑制方面具有应用前景。

参考文献：

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