细胞凋亡相关因子与耐药性的关系研究进展

郭淑芹 马静静 张云良

细胞凋亡和肿瘤多药耐药是目前制约肿瘤临床疗效的两个重要因素，多数抗肿瘤药物通过诱导细胞凋亡而发挥作用，如果发生凋亡逃逸即细胞抗凋亡能力提高如抗凋亡基因过表达或促凋亡基因丢失等，可能导致肿瘤细胞产生耐药性。细胞凋亡功能的异常不仅在肿瘤的发生与发展过程中发挥重要作用，还参与介导肿瘤细胞的MDR，使肿瘤细胞对多种化疗药物诱导的凋亡耐受而产生耐药性。许多调节细胞凋亡的因子如SIRT1、Survivin、PUMA等可参与耐药的发生。

1 P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)

P-gp定位于染色体7q21，含1 280个氨基酸，是一种由人类(Multi-drug resistance 1 gene，mdr1)编码的分子量为170 kD的跨膜糖蛋白，是ATP结合盒超家族(ATP-binding casette super family)成员之一，由两个包含跨膜区和ATP结合区的同源性片段组成。P-gp主要定位于细胞膜上，该蛋白广泛分布于小肠、胆管、胰腺等具有排泄和分泌功能的器官，其主要功能是通过结合ATP活化后将细胞内的药物泵出细胞外而降低胞内药物浓度，导致许多恶性肿瘤化疗失败。细胞耐药既是正常细胞维持自身稳定的防御机制之一，也是引起肿瘤化疗失败及肿瘤复发的主要原因。多药耐药基因表达的P-gp是化疗耐药的最有力指标，P-gp可以将肿瘤细胞中不同结构的药物如长春花生物碱类、蒽环类、表鬼臼毒素、秋水仙碱、紫杉烷类等泵出细胞外［1］。P-gp的含量和细胞内药物的积聚量和耐药程度呈明显的相关性。

2 沉默信息调节因子1(silent information regulator type 1，SIRT1)

SIRT1是依赖于NAD+的Ⅲ类组蛋白脱乙酰酶，是sirtuin家族中研究最为广泛的成员之一，在体内可将组蛋白及多种非组蛋白去乙酰化，参与细胞增殖、分化、凋亡等多种生物学过程，可延缓衰老，有“长寿基因”之称［2］，并能促进细胞生长、血管再生、血供重建、增强对化疗的耐药性，在肿瘤的发生、发展和耐药方面起重要作用［3］。研究发现，SIRT1蛋白在多种实体瘤中高表达，通过调节凋亡相关因子 p53［4］、C-MYC［5］、沉默抑癌基因［6］、促进 MDR1的表达［7］参与肿瘤的发生发展及耐药。在正常细胞中SIRT1是十分重要的抗衰老、抗代谢性疾病的蛋白，在肿瘤细胞中，正是SIRT1的抗凋亡作用使突变细胞逃避凋亡和衰老控制，而助于肿瘤或某些代谢性疾病的发生。

5种临床肿瘤的活检标本和不同细胞来源的耐药细胞中，均发现SIRT1高水平表达，直接诱导MDR1的表达。用瞬时转染实验技术证明:在人的293细胞中，SIRT1可直接诱导MDR1的表达，导致细胞对药物的敏感性降低。SIRT1在活化的状态下介导MDR1基因表达，使用RNAi特异性降低SIRT1表达后，P-gp和MDR1的表达明显降低，提示长寿基因不仅与多药耐药性存在联系，而且在多药耐药性中起积极作用。进一步证实，SIRT1异位高表达诱导P-gp表达，使细胞对多柔比星产生耐药性，下调SIRT1能逆转抗药显性并且可以降低 P-gp 表达［8］。Ford 等［9］发现，SIRT1 的干扰能减低肿瘤细胞对一些药物的敏感性，引起细胞生长的阻滞，通过下调SIRT1基因表达能促使恶性肿瘤细胞凋亡，且不影响正常细胞的生长，与上述结果一致，利用siRNA技术将SIRT1沉默后，体外培养的肿瘤细胞对药物的耐受性降低并被诱导为生长停滞状态［10］。FoXO1是 MDR1基因转录的关键调节因子［11］，FoXO1可被 SIRT1 去乙酰化，SIRT1 高表达可以增强FoXO启动子的活性和细胞核中FoXO1的水平。Oh等［12］研究发现，在人乳腺癌MCF-7/ADR细胞中，FoXO1结合到MDR1基因启动子上是反式激活MDR1基因的关键事件，提示FoXO1可能是多药耐药的靶点。

白藜芦醇作为一种重要的植物抗毒素，可通过多种途径预防肿瘤的发生，是继紫杉醇之后的又一新的天然多酚类化合物。体内实验研究发现，白藜芦醇联合应用化疗药物5-氟尿嘧啶可降低CYP1B1基因的表达，发挥更强的抑制肿瘤生长作用。因此，白藜芦醇可以作为一种辅助药物来改善胆管癌对化疗药物的敏感性［13］。黄柏苷G(amurensin G)是从山葡萄中提取的天然SIRT1抑制剂，在应用于耐药乳腺癌MCF-7/ADR细胞后，可以抑制FoXO1的活性和MDR1的表达，证实SIRT1在MDR1基因转录中起重要作用，黄柏苷G有望成为一种新型的治疗肿瘤耐药的抑制剂。

SIRT1去乙酰化酶抑制剂不仅能抑制肿瘤细胞增殖诱导细胞发生凋亡，抑制癌基因表达且毒副作用低，为克服肿瘤细胞多药耐药性提供可能，从而为逆转肿瘤细胞的多药耐药提供理论基础，最终为治疗肿瘤提供有力的线索。因此针对SIRT1的靶向治疗是当前肿瘤治疗的一个热点，用SIRT1去乙酰化酶抑制剂克服肿瘤细胞的多药耐药性，有可能具有应用前景。

3 生存素(Survivin)

Survivin蛋白是凋亡抑制基因家族(inhibitor of apoptosos，IAP)中的一员，普遍存在于原核和真核生物组织中，具有调节细胞分裂和抑制细胞凋亡的双重作用，是迄今为止发现的最强的凋亡抑制因子，可抑制多种刺激因素诱导的凋亡，参与细胞周期调控，使细胞存活，利于细胞的异常增殖和恶性转化，其高表达可抑制多种因素诱导的细胞凋亡。Survivin可直接抑制casepase-3和 casepase-7的活性，有效阻断细胞凋亡过程［14］，该机制被认为是产生化疗药物耐药的重要机制。有研究证明，下调Survivin表达可提高多种癌细胞对化疗药物的敏感性［15-17］。Souza等［18］通过应用Western blot、RT-PCR、免疫荧光测定法对早期敏感CML细胞株K562中P-gp和Survivin的检测，证实了二者之间的关系，在K562细胞中大剂量的长春新碱可以诱导P-gp和Survivin高表达，同时伴随细胞凋亡指数的降低，另外发现P-gp和Survivin同时定位于细胞质，提示二者可能通过某种共同的机制调控细胞凋亡。Survivin作为肿瘤内在凋亡系统中的共同靶点，与细胞信号传导通路 PI3K/AKT、mTOR、HIF-1α、HSP90、p53、Bcl2、VEGF 等有着直接的调控关系［19］，PI3K/AKT信号通路参与细胞周期进展、细胞凋亡和致癌性转化，Liu等［20］证实在多药耐药性乳腺癌 MCF-7中Survivin转录与P-gp/MDR1过表达相关，应用特定的PI3K抑制剂LY294002后，二者的表达降低，同时抑制了Survivin启动子的活性，增强了细胞对药物的敏感性，Survivin转录通过 PI3K/AKT信号通路与 P-gp/MDR1相关。许多化疗药物可通过损伤DNA、诱导细胞凋亡而发挥作用，而凋亡抑制蛋白Survivin可在药物作用靶点后抑制化疗药物诱导的肿瘤细胞凋亡而产生MDR表型。陈建发等［21］研究证实Suvivin siRNA可显著抑制结肠癌细胞HT-29内的Survivin表达，Survivin表达下调可能导致了caspase-3、Bax基础表达水平的提高以及Bcl-2基础表达水平的降低，并使细胞凋亡线粒体信号通路更易活化，从而降低结肠癌细胞HT-29对化疗药物cisplatin更加敏感，进而提示通过siRNA技术下调survivin表达，可能是靶向治疗结直肠癌的一个可行手段。

血根碱(sanguinarine)最近被证实是一种新型的Survivin抑制剂，并且高选择性的杀灭前列腺癌细胞，在激素非依赖性前列腺癌的进展及对化疗药物的抵抗中发挥着重要作用，可能增加紫杉醇对肿瘤的敏感性，增强紫杉醇介导的肿瘤抑制与细胞凋亡［22］。在肿瘤疫苗方面，Tsuruma等［23］开始了Survivin-2B多肽疫苗治疗结直肠癌的I期临床试验。Survivin的凋亡抑制作用在生命科学的研究领域受到了广泛关注，已成为具有潜在价值的肿瘤标记物和肿瘤治疗的潜在靶点，在逆转肿瘤恶性行为及治疗方面具有广阔的前景。

4 p53上调凋亡调控因子(p53 up-regulated modulator of apoptosis，PUMA)

PUMA基因是2001年由三个研究小组应用不同的策略发现的，是Bcl-2蛋白家族成员，因其可被p53快速诱导并具有强大的促凋亡作用而得名，也因其强大的促凋亡作用使得它在生命科学研究领域备受关注。

PUMA基因定位于染色体19q，这个区域在大多数肿瘤中显示缺失，蛋白定位于线粒体外膜，在多种病理性因素的刺激下通过p53依赖和非依赖途径激活后，其BH3结构域与Bcl-2抗凋亡蛋白质结合及激活Bax/Bak，引发线粒体功能障碍和caspase级联反应介导细胞凋亡，在凋亡通路上发挥着至关重要的作用［24］。PUMA不仅能够诱导多种肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖，而且还能增加肿瘤细胞对放化疗的敏感性，是非常有前景的肿瘤基因治疗靶点。Yu等［25］将携带PUMA的重组腺病毒载体(Ad-PUMA)转染到人肺腺癌549细胞中，并同时分别给予放疗和化疗药物紫杉醇、5-氟尿嘧啶、奥沙利铂、顺铂等治疗，发现在非放化疗敏感性肺癌中，PUMA通过活化caspase，释放Cytc，诱导肺癌细胞凋亡，抑制细胞增殖;而在放化疗敏感性肺癌系中PUMA能通过诱导细胞凋亡显著增强肺癌细胞对放疗及化疗药物的敏感性，并且发现Ad-PUMA可显著抑制裸鼠皮下肿瘤的生长。Chen等［26］在对裸鼠耐药绒癌细胞jeg-3/vp16的研究中发现，在进行化疗之前先用Ad-PUMA感染此耐药细胞，当加入化疗药物时，由PUMA表达下降导致的凋亡通路受阻已得到修复，此时化疗药物对肿瘤细胞的杀伤作用得以充分实现，与未合用Ad-PUMA的对照组相比，肿瘤细胞对化疗药物的敏感性明显增加，证实Ad-PUMA可显著增加耐药绒癌对化疗药物的敏感性，Ad-PUMA与化疗药物合用后显著促进绒癌细胞的凋亡。Wang等［27］将携带PUMA和p53的重组腺病毒载体(Ad-PUMA、Ad-p53)分别与化疗药物顺铂、紫杉醇、5-氟尿嘧啶联合处理人食管癌细胞后发现，PUMA可通过诱导细胞凋亡显著增强食管癌细胞对化疗药物的敏感性，且此增敏作用与p53无关，与Ad-p53相比，Ad-PUMA能更强地抑制癌细胞生长，增加癌细胞对化疗药物的敏感性。

关于MDR，目前临床上还有许多需要解决的难题，多药耐药的逆转就是其中之一，现已发现多种作用机理不同的逆转剂作用于MDR的各个环节，但由于毒性等多种原因，在临床应用受到限制，尚待进一步研究。随着分子生物学研究的深入，越来越多的多药耐药相关基因及细胞因子陆续发现，人们对肿瘤的耐药机制有了更深入的理解，许多提示耐药与凋亡存在内在联系的证据也相继被发现。这些研究为进一步阐明两者之间的调控影响机制提供了新思路，揭示了其中复杂多样的调控因素。通过深入研究肿瘤抗药性与凋亡的关系，相信将有助于更好地指导肿瘤的临床治疗。

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