昆虫分类学主要技术手段的研究进展

南宫自艳，李 静，白向宾

(河北农业大学植物保护学院，河北保定 071000)

昆虫经过约3 亿8 千万年的演化，已经发展成地球上种类繁多、数量巨大、分布广泛的动物类群之一(王心丽，2001)。全世界约有昆虫1000多万种，目前已发现、定名的昆虫约100 多万种。面对如此种类繁多的昆虫家族，如何鉴定、辨别及进行明确的分类归纳显得尤为重要，所以昆虫分类学应运而生。昆虫分类学是研究昆虫类别及其异同和历史渊源关系，并据此建立分类系统，以总结昆虫进化历史，反映昆虫家族自然系谱的一门基础学科。传统的分类学主要从综合形态特征、生物学性状及地理学信息等多种角度入手加以区分。然而面对昆虫家族丰富的物种多样性，这些传统的分类方法遇到了诸多挑战。随着科学技术的发展，特别是20 世纪70年代以来，分子生物学迅猛发展，极大地促进了分子生物技术在昆虫分类学上的应用发展。本文将从传统分类学方法和现代生物技术2个方面介绍我国昆虫分类学的研究进展。

1 传统的分类学方法

20 世纪中叶以来，我国生物分类学领域出现了一些新的理论学派。以陈世骧为代表的进化分类学派主要开展了物种概念论、特征分析标准以及进化论与分类学关系的研究(陈世骧，1987)。其物种隔离概念、生态特征、行为特征、分布特征、形态特征的分析与判别方法，目前仍然是国内分类鉴别和区系研究的基本指导思想。

支序分类理论及方法诞生于20 世纪60年代，80年代初才在我国昆虫分类研究中得到应用。尹文英(1983)、朱弘复(1984)以及黄大卫(1996)等关于支序分析方法及昆虫的分支系统学研究都曾经取得令人瞩目的成就。董建臻等(1997)利用支序分类的原理和方法，系统研究了长蝽类Lygaeoid 亚科以上阶元间的系统发育关系。江世宏等(2001)运用支序分类的原理和方法，利用计算机支序分类软件进行数据处理，得出中国叩甲科Elateridae 昆虫12 亚科的谱系图。

数值分类学是借助数值根据其性状状态将分类单位归类成类元，其核心就是将所有的分类性状加以等权处理，再以性状间的相似性来进行归类。目前，昆虫分类系统主要采用的形态学依据有:昆虫的颜色和斑纹;翅的有无、性质以及翅脉脉相;口器的类型及其变化;触角类型及节数;身体附属物类型及其大小;马氏管的数目;生殖器官及其他结构部位的形态特征(查玉平等，2005)。利用数量性状变异在区分某些形态差别不显著的昆虫时是非常有效的手段，方法如系统聚类、动态聚类、图论法、主成分分析、因子分析、对应分析和模糊聚类等(喻泓等，2004)。朱弘复等(1975)利用数值分类的方法进行蚜虫的系统发育分类，开创了数值分类应用于我国昆虫分类的先河。刘友樵等(1982)和陈斌(1989)也都应用数值分类分别对草蛾属Ethmiids 与星天牛属Anoplophora 进行分类研究。许升全等(1999)通过对蝗总科Acridoidea 昆虫雌性下生殖板性状的数值分类进行系统发育关系的研究，这是高级分类阶元数值分类的一个示例。南宫自艳等(2013)的研究发现马尾松毛虫、落叶松毛虫、云南松毛虫、思茅松毛虫4种松毛虫的8个表型性状(蛹重、蛹长、雌雄虫体重、雌雄虫翅展和雌雄虫体长)在4种松毛虫之间差异极显著;主成分分析表明蛹长、雌虫体重和雌虫翅展3个主分量构成的信息量基本能代表这8个性状的变异;系统聚类的结果为马尾松毛虫与落叶松毛虫聚为第一分支，思茅松毛虫和云南松毛虫聚为第二分支。

2 现代生物技术在昆虫分类学中的应用

昆虫生存环境的改变引起新陈代谢和机能的改变，从而导致形态结构的改变，仅从表型上不能解决诸如形态极其相似的近缘种分类问题，对物种的进化关系也不能很好反映。随着分子生物学技术的兴起及日臻成熟，各种分子标记技术大量出现，不但能协助传统分类学方法揭示相似姊妹种之间的差异，更有助于发现物种的起源和进化规律以及田间昆虫抗性种群的遗传变异(Parker et al.，1998;龚鹏等，2001;Yuan et al.，2012)。

2.1 同工酶和等位酶电泳技术

同功酶(isozyme)是具有相同或相似的催化功能而分子结构不同的一类酶。自从Hunter 和Markert(1957)创立了同功酶酶谱(zymogram)技术以来，同功酶的研究得到了很大的发展。通过同功酶研究，可以由生化特征的差异来推测物种乃至属、族、亚科等高级分类阶元在蛋白水平上的异同，进而可推测其亲缘关系和进化地位。韩雅莉等(1998，1999)采用聚丙烯酰胺凝胶电泳对斑翅蝗科Oedipodidae 和网翅蝗科Arcypteridae部分种类进行酯酶同工酶研究，发现各自特有的酶带在不同种类蝗虫中差异显著。鳞翅目害虫多以幼虫危害作物，但幼虫形态分化不明显，其近缘种、近似种更难区别，应用同功酶测定技术则可以快速鉴定种类。例如阎一林等人(1987)的研究证实可以通过同功酶电泳分析快速区分棉铃虫 Helicoverpa armigera(Hübner)和 烟 青 虫Helicoverpa assulta(Guenee)。罗梅浩等(1999)对云南、河南、北京地区来自不同体色、不同寄主的烟青虫H.assulta(Guenee)种群进行酯酶同功酶酶谱分析，表明河南种群与北京种群之间异较小，与云南种群之间差异较大。不仅如此，同功酶研究还为昆虫种类更高阶元的合理划分提供科学依据，甚至对一些阶元的能否成立提出肯定或否定的结论。聂传朋等(2005)分析研究了叶甲亚科Chtysomelinae 5种昆虫的酯酶同工酶的酶谱，表明该法所得到的分类结果与形态学分类一致。李绍文等(1987)研究了膜翅目昆虫7个总科、蜜蜂总科9个属、蜜蜂属6个种和西方蜜蜂4个种样品的酯酶同工酶，发现总科间酶谱的差异大于总科内各属间的差异，属内各种间的酶带差异不显著，但每个种都有其特有的酶带。

等位酶是由单个位点上等位基因编码的同工酶，选取一批受单位点不同等位基因编码的等位酶作为整个基因组的随机样本，可以比较客观地度量生物遗传变异的大小，并作为遗传标记研究其它相关问题(Gottlieb，1981;Soltis，1989;葛颂，1994)。由于等位酶谱带同等位基因之间的明确关系，使其成为一种十分有效的遗传标记，是近年来检测遗传多样性应用最普遍的方法，在昆虫系统发育学的研究中应用广泛(王仲仁，1996)。徐广等人(2000)利用聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳检测了棉铃虫H.armigera(Hübner)的13种等位酶，结果表明棉铃虫种群内存在很高的遗传多态性，种群间遗传分化程度较小，种群间没有基因交流的障碍，由此推测是迁飞阻碍了不同地理种群间的遗传分化。南宫自艳等(2008)采用等位酶电泳技术研究了松毛虫属Dendrolimus 4种共9个地理种群的遗传多样性和遗传分化，研究结果证实松毛虫居群间存在较少的基因交流和较大的遗传分化，并同时采用传统的数值分类法对结果加以佐证(南宫自艳等，2013)。由此可见，传统的形态学分类及数值分类与分子生物学结合进行昆虫分类的研究，可以使各分类阶元内及不同阶元间的系统发育关系及遗传分化得到更精确的区分，并为纠正传统分类中的偏差提供了一个有效的方法。

2.2 比较线粒体基因组学

线粒体是一种几乎存在于所有真核生物的细胞器，与能量代谢、凋亡、衰老以及疾病相关，是氧化磷酸化的场所(魏书军等，2011)。动物线粒体基因组(mtDNA)具有基因组成稳定、基因排列相对保守、普遍为母系遗传、极少发生重组等许多共有特征(Wolstenholme，1992)，是目前研究种群遗传变异分化、以及区别近缘种、种下分类单元鉴定中最常用的遗传物质之一(Wilson et al.，1985)。昆虫作为地球上种类最为繁多、生物学习性最为复杂的生物，一直以来都是线粒体基因组研究的热点类群(Boore，1999;Chen et al.，2011)。

常用的mtDNA 基因有细胞色素B(Cyt b)、细胞色素氧化酶I(COI)、细胞色素氧化酶II(COⅡ)、12SRNA、16SRNA、细胞核核糖体DNA转录间隔区(ITS)、NADH 脱氧酶亚基1(ND1)、NADH 脱氧酶亚基2(ND2)、NADH 脱氧酶亚基5(ND5)。相比其他基因片段来讲，COI 相对保守并且容易被通用引物扩增出来，同时也有足够的变异将不同物种区分开(Wang et al.，2012);线粒体12S 和16S 基因也被广泛用于系统发育分析中，但这类基因本身存在大量的插入和缺失现象，使序列比对受限;COILND1 及ND5 均属进化比较快的基因，适用于区分亲缘关系较密切的种类。而Cyt b 基因是mtDNA 蛋白质编码基因中结构和功能研究得最为清楚的基因之一，在昆虫分类学及遗传进化研究中的应用也更为广泛(张学卫，2010)。Huang 等人(2000)应用Cyt b 基因和16S rRNA 基因序列的联合数据对北美蟋蟀属Gryllus 11种13个种群的系统演化关系进行了分析，发现欧洲的Gryllus 属与北美洲的Gryllus 属间具有明显的分枝，种间差异大于种内差异。国内学者应用Cyt b 基因进行的研究工作也日益增多。任竹梅等(2002，2003)对蝗总科8 科10种昆虫的Cyt b 基因部分序列进行测定分析，提出了8 科的亲缘关系与传统分类学不完全一致;同时对山稻蝗Oxya agavisa 及其相关物种Cyt b 基因序列进行遗传关系研究。李爱玲等(2004)分析了我国野桑蚕Bombyx mandarina 的Cyt b 序列并与日本野桑蚕进行了比较分析，结果显示中国野桑蚕B.mandarina与家蚕B.mori 品种序列的遗传分化时间远远早于日本野桑蚕和家蚕品种相应序列的分化时间，在分子水平上证实了家蚕起源于中国野桑蚕。王帅宇等(2005)发现Cyt b 基因可以作为露螽属Phanerotera种间的分子遗传标记，研究结果表明镰尾露螽Phanerotera falcate 与齿尾露螽Phanerotera myollecrca 是分化较晚的类群，其次是瘦露螽Phanerotera gracilis，黑角露螽 Phanerotera ngiroantennata 是分化较早的类群。

2.3 随机扩增片段长度多态性(RAPD)

RAPD(Randomly Amplified Polymorphic DNA，简称RAPD)原理是用长度为9-10 bp 的随机核苷酸引物，对基因组的DNA 进行非定点PCR 扩增，不同物种的基因组中与引物相匹配的碱基序列的空间位置和数目都有可能不同，扩增产物的大小和数量也有可能不同，这些差异可以通过凝胶电泳显示出来，从而进行遗传多态性的分析(Williams，1990;Karama et al.，2008)。RAPD 具有技术简单、检测迅速、只需少量的DNA 样品、成本较低等优点。Pradeep 等(2005)利用RAPD方法研究了家蚕B.mori 长幼虫期群体和短幼虫期群体4 代幼虫之间基因多态性差异，在这两个不同的群体中表现出丰富的基因差异。张爱兵等人(2004)利用RAPD-DNA 指纹谱方法对中国松毛虫属Dendrolimus 8个种和亚种的亲缘关系进行比较，结果表明马尾松毛虫Dendrolimus punetatus punetatus Walker 和德昌松毛虫 D.punctatus tehchangensis Tsai et Liu 遗传距离最近，与文山松毛虫D.punctatus wenshanensis Tsai et Liu.、赤松毛虫D.spectabilis Butler、落叶松毛虫D.superans Butler、云南松毛虫D.houi Lajonquiere 遗传距离次之，与思茅松毛虫D.kikuchii Matsumura 遗传距离最远。杨效文等(1999)用RAPD 技术研究了我国烟草上烟蚜Myzusper sicae Sulzer 的种群分化，数据显示烟蚜的不同地理种群和不同体色之间DNA 均呈现出多态性，证实我国烟草上烟蚜的分化仅在种群水平上，并未达到亚种水平。唐桦(2002)结合RAPD 分子标记和同工酶电泳两种方法证明光肩星天牛Anoplophora glabripennis 和黄斑星天牛Anoplophora nobilis 应统属一个种，而在光肩星天牛这一种下可分为三个型:白斑型、黄斑型、黄白杂合型。

2.4 微卫星DNA

微卫星DNA，也称为简单序列重复(Simple Sequence Repeat，SSR)DNA，其核心结构是由1-6个核苷酸为重复单位串联组成的长达几十个核苷酸的序列，微卫星DNA 的两侧是相对保守和专一的单拷贝序列，利用侧翼序列设计引物可以特异性扩增微卫星位点，使微卫星DNA 从基因组中被选择性地扩增出来，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳对扩增带进行多态性分析(Zhang，2004)。SSR标记在真核生物基因组中数量多且分布均匀，具有高度的多态性和保守性，遵循孟德尔式遗传规律和共显性遗传模式，是一种非常高效、准确的系统发育学研究技术(Huntley and Clark，2007;Behura et al.，2012)。张德兴(2004)研究发现在鳞翅目粉蝶和蛾类昆虫中基因组所存在的微卫星序列具有近似或者完全相同的侧翼序列，这一研究结论为鳞翅目昆虫微卫星丰富度较低提供了可能的解释。吉亚杰等(2005)通过构建基因组文库的方法筛选了10个马尾松毛虫微卫星多态性位点，但这10个位点不能完全应用于松毛虫属其他种松毛虫，再次说明了微卫星标记保守性和专一性强这一特点。Koshio 等(2002)通过对鳞翅目舞毒蛾Lymantria dispar L.3个微卫星位点进行遗传多态性分析，结果表明微卫星标记可以应用于该物种种群亲缘关系鉴定。沈利(2004)筛选得到家蚕22 对具有多态性的微卫星引物，研究发现家蚕品种可分为欧、日、中三大类，证明家蚕微卫星标记具有品种特异性，可以用作家蚕指纹图谱分析的工具。

2.5 单链构象多态性分析

单链构象多态性分析(Single-strand conformational poly-morphism，SSCP)原理是变性后的单链DNA 在不含变性剂的中性聚丙烯酸凝胶电泳时，迁移率除与DNA 的长短有关外，更主要的是取决于DNA 单链所形成的构象。这种构象由DNA 单链碱基顺序决定，其稳定性靠内部局部顺序的相互作用来维持，相同长度的单链因其顺序不同，甚至单个碱基的不同，所形成的构象不同，导致迁移率的变化而出现泳动变位(刘美佳等，2011)。SSCP 方法灵敏性高，所以这一分析技术广受关注(Malekmohammadia et al.，2012)。Hiss等(1994)应用SSCP 分子标记法对胡蜂Vespidae及其科内的几个近缘种昆虫DNA 进行了研究，结果发现近缘种间的差异表现为单个核苷酸的替代，这种差异可以作为区别近缘种的依据。Coustaut 等(1995)利用SSCP 技术成功地区分黑腹果蝇Drosophila melanogaster 和地中海果蝇D.simulans，而这两个近似种以前只能依靠雄外生殖器来鉴别。Sedlimair 等(2000)应用SSCP 技术研究了步甲亚属Orinocarabus 的进化关系。李石柱(2003)应用SSCP 分析多斑按蚊复合组(Anopheles macu-lates complex)5个成员种的28S 编码区第3 结构域的单链构象多态，结果表明该技术可以用于各蚊种的鉴别研究。

3 问题与展望

现在对于昆虫的分类鉴定，形态学观察仍是最主要的研究手段。随着分子生物学的迅猛发展，新的研究技术对昆虫形态学之外的其他特征进行分析，使研究方式由表及里，由宏观转向微观，是对传统昆虫分类方法的一个补充与完善。同工酶电泳技术、核酸序列分析、RAPD 技术、SSR 技术、SSCP 等分子生物学技术在昆虫分类研究中的应用和有益探索，其准确、客观、灵敏的优点尤为突出，验证了以往的研究结论，弥补了传统分类方法的不足，解决了传统分类中所存在的学术疑难问题。但目前我国现代生物技术在昆虫分类方面的应用还处于起步阶段，由于应用时间不长，无论是试验技术还是数据处理分析都还有待完善，适用范围也有一定的限制。总之，昆虫分类学是一门综合性学科，在利用外部形态进行鉴定的基础上，可以利用解剖学、遗传学、分子生物学、生物化学等多学科联合，各取所长，提高效率，昆虫分类学研究技术将会有长足的进步和发展。

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