家养野猪脑心肌炎病毒的分离、鉴定及全基因组序列分析

常洪涛，刘慧敏，赵 军，陈 陆，杨 霞，王新卫，姚惠霞，王川庆

脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus，EMCV)是一种重要的人畜共患疫病病原[1]，属小RNA病毒科、心病毒属，可以感染猪、野生动物、啮齿动物和灵长类动物等[2-3]，近年来人感染发病也时有发生[4-5]。自然条件下，鼠类是EMCV的自然贮存宿主和传播者[6-7]，但其感染最广泛和最严重的动物是猪，临诊上主要引起母猪繁殖障碍及断奶仔猪的脑炎、心肌炎和急性死亡等[8-9]。自1958年巴拿马猪群中首次发生疫情以来，许多国家相继报道了该病的存在和发生。中国自2005年从疑似病死猪体内成功分离到首株EMCV并作较多研究[10-17]。特对家养野猪EMCV河南株进行分离、鉴定和全基因组测序解析，以期了解不同猪种对EMCV的易感情况。

1 材料与方法

1.1病料采集和病毒的分离鉴定 2012年5月收集河南省焦作市某养猪场送检的疑似发病家养野猪的心脏、淋巴结和脾脏等标本，-20 ℃冻存待用。病毒分离、电镜观察和初步鉴定等工作均参考盖新娜等[10]的方法进行。

1.2RT-PCR及测序 取分离毒的细胞培养液，使用TRIZOL提取总RNA。参考文献[18]中的各片段特异性引物和反应条件，分别进行RT-PCR扩增、基因克隆和序列测定。并应用Chromas2.33软件进行拼接，获得全基因组序列。

1.3同源性比较与系统进化分析 运用MegAlign程序，将分离毒全基因组序列与19株从NCBI GenBank搜集下载的EMCV参考毒株的基因序列及其推导的氨基酸序列进行同源性分析，并构建系统进化树。

2 结 果

2.1病毒分离及鉴定 从疑似病料组织中成功分离到1株家养野猪EMCV，命名为JZ1202株。在透射电镜下可以清晰观察到数个形状规则，直径大小约为25～29 nm的圆形病毒粒子(图1)。1～4代分离毒细胞培养物的TCID50经测定，分别为10-6.32/0.1 mL、10-5.9/0.1 mL、10-7.42/0.1 mL和10-7.63/0.1 mL；分离毒经终浓度为4.8%分析纯氯仿处理后，其TCID50为10-5.78/0.1 mL，略低于对照组的10-7.63/0.1 mL，但仍可判定为不敏感；分离毒经1%胰蛋白酶溶液37 ℃消化1 h后，其TCID50由10-7.63/0.1 mL降低到10-3.94/0.1 mL，说明对胰蛋白酶较为敏感；病毒液在pH3.0的酸性环境中作用1 h后，其TCID50由10-7.63/0.1 mL降低到10-3.53/0.1 mL，表明该分离毒不耐酸；将分离毒分别置于37 ℃、50 ℃、60 ℃和70 ℃时处理1 h，发现37 ℃时病毒滴度并无明显变化，50 ℃时其TCID50由10-7.18/0.1 mL降低至10-4.25/0.1 mL，60 ℃时已完全失活，失去感染力，从而表明该分离株对热敏感；将分离株置于1.1 mol/L MgCL2溶液中50 ℃水浴1 h，测定TCID50为10-4.32/0.1 mL，与对照组的10-3.99/0.1 mL差异不明显，说明二价阳离子对分离毒并未有保护作用。

图1JZ1202株感染BHK-21超微形态电镜图

Fig.1UltrastructuralmorphologicfeaturesofJZ1202strain-infectedBHK-21cellscollectionsofpicornavirusparticles

2.2病毒基因组序列及结构分析 通过序列拼接，JZ1202株的基因组全长为7 735 bp(GenBank：KF836387)，其中5′-UTR包含724 bp，3′-UTR包含132 bp，中间为一个大的ORF(6 879 bp)编码的由2 292个氨基酸组成的多聚蛋白，该多聚蛋白可切割成1个病毒自身编码的前导蛋白(L)和11个蛋白终产物(1A～1D、2A～2C和3A～3D)(图2)。

图2 JZ1202株的全基因组结构图

2.3病毒全基因组及各基因片段的同源性比较 全基因组序列分析结果表明，JZ1202株与国内外不同动物源EMCV参考毒株的核苷酸同源性为81.2%～99.9%，其中与国内猪源分离毒(GXLC、GX0601、BJC3、HB1、NJ08和BD2)的同源性高达99.4%以上，与韩国猪源分离毒(CBNU、K3和K11)和欧美猪源分离毒(PV21、EMC-D、D variant和EMCV-30)的同源性分别为99.4%～99.6%和83.6%～99.3%，与国内(GX0602)、外(PEC9和Rz-pMwt)鼠源毒株的同源性分别为99.4%和81.3%～99.5%。进而与参考毒株ORF和各基因片段的核苷酸、氨基酸序列比对分析，发现JZ1202株结构蛋白中，VP1变异幅度最大，VP2最为保守；非结构蛋白中，2A变异幅度最大，3D最为保守；非结构蛋白编码区相比结构蛋白编码区较为保守。将VP1蛋白与国内猪源EMCV比较后发现，氨基酸变异多发生在7～63位，7位由K→R，13位与GXLC均由A→T，63位与BD2、BJC3、HB1均为Q，不同于GX0601和GCLX的G。

2.4病毒系统进化分析 基于JZ1202株全基因组、ORF和VP1基因序列绘制的系统发育进化树显示(图3)，可见EMCV分为 G1、G2和G3 3个群。猪源EMCV主要分布在G1群和G2群，鼠源 EMCV 在G1群和G3群中均有分布。JZ1202株与HB1亲缘关系最近，并与国内的良种猪源、鼠源和华南虎源EMCV同属于G1群。

图3 基于JZ1202株全基因组(A)、ORF(B)和VP1基因(C)核苷酸序列的系统进化树

3 讨 论

据统计，目前感染人的病原体中60%属于人兽共患病，而这些病原体71%以上源于野生动物。近年来，野猪及相关产品作为绿色食品的重要来源之一，因其独特的营养价值和风味而日益备受青睐，国内各地都在进行野猪资源的开发利用，如野猪家养或作为父本经济杂交以满足人们的消费需求。但随之而来的问题是，由于野生生态环境改变，接触家猪机会频繁以及屠宰、加工、消费环节中存在的风险因素，都使得野猪携带多种病原体并感染家畜和人类变成可能。国内已分离到多株良种猪源EMCV，但有关家养野猪源EMCV的研究尚未见报道，因此开展其分离、鉴定和遗传演化工作，可为研究EMCV的分子流行病学特征、分子生态学、疫苗毒株筛选和制定综合防控措施提供科学依据。

JZ1202株分离自家养野猪，通常情况下该猪种抗病力极强，而该毒株的成功分离证实EMCV可感染家养野猪并导致发病，但其是否来源于良种猪或是由于传统饲养模式改变而导致的自身内源感染，则有待进一步研究。另外，EMCV在疑似病料组织中的含量很低，生产中也多表现为亚临床感染，因此病毒的直接分离、鉴定等工作难以直接开展。笔者曾多次尝试应用常规RT-PCR方法从病料中直接检测EMCV，但从未获得成功。由于猪瘟病毒(SCFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS)、猪圆环病毒(PCV)、猪伪狂犬病毒(PRV)和猪细小病毒(PPV)等多种猪重要病毒性病原均无法在BHK-21细胞上增殖，而EMCV接种后则很快能出现明显细胞病变(CPE)。因此，作者先将疑似病料处理后接种BHK-21细胞，一旦出现CPE后再用RT-PCR方法进行检测，最终成功分离到国内首株家养野猪源EMCV。这种改进的“细胞接种与RT-PCR方法相结合”技术，一方面可利用细胞接种技术进行初步鉴定，另一方面则大幅提高了病料组织中EMCV的检出率和分离率。

开展不同猪种EMCV地方分离株的基因组序列测定与分析，对丰富病毒流行病学资料和研究病毒结构与功能的关系至关重要。本研究成功获得JZ1202株全基因组序列，分析结果表明，该病毒与国内猪源EMCV分离毒株高度同源，说明可能彼此间交叉感染或具有共同感染来源，从而提醒我们在进行野生动物养殖活动中要充分考虑人兽共患疫病传播的生态学。另外，该毒株与韩国分离株的亲缘关系较近，与绝大多数欧美分离株的亲缘关系较远，但与德国分离株X74312的同源性高达99.3%，从而提示EMCV存在较大的地域差异，但传播应有一定范围内的区域限制性，日益发达的国际交通和贸易可能会加速EMCV的扩散。

现有研究表明，EMCV在猪只之间传播能力有限，而鼠类等啮齿目动物在猪群EMCV的传播过程中具有重要作用。在本研究中，JZ1202株与国内鼠源毒株的同源性高达99.6%，亲缘关系极近，从而提示EMCV在家养野猪和鼠之间可能存在着交叉感染与传播，但要对鼠在EMCV传播中的精确定位仍需做进一步研究，而做好猪场内及周边的灭鼠工作，却无疑会对有效防控猪EMCV感染至关重要。

VP1基因是EMCV基因组中最重要的中和性抗原表位所在区域，变异幅度最大，其氨基酸序列与致病性密切相关，因此对其开展相关研究最具价值。本研究通过对JZ1202株与国内猪源参考毒株的全基因组、ORF和各基因片段进行比较，发现彼此间尽管同源性很高，但VP1蛋白已出现细微变异，提示EMCV在感染家养野猪时可能会发生个别氨基酸的突变，以适应新的猪种。

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