恒河猴H5N1禽流感病毒性肺炎模型建立及其发病机制

黎东明，赖天文，邓少嫦，吴 东，张 钰，陈 敏，吕莹莹，吴 斌

禽流感是由禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)引起的一类人兽共患传染性疾病或疾病综合征。1997年，香港首次发生了高致病性禽流感(High Pathogenic Avian Influenza,HPAI)H5N1病毒直接感染人事件。至2012年，WHO公报显示H5N1亚型AIV在全球已造成了610人感染，其中360人死亡，确诊患者的死亡率大约60%[1-2]。H5N1病毒逐渐从亚洲蔓延至欧洲大部分国家以及非洲部分国家，共计56个国家和地区，近期一些研究结果表明H5N1禽流感病毒可以通过变异、重组而能在人群中传播，从而严重威胁人类的生命健康，引人关注[3]。因此，深切探讨病毒的发病机制是必要的。

人感染H5N1病毒的一个主要病理特点是弥漫性肺泡损伤。严重的病毒性肺炎是高致病性H5N1病毒感染最常见的并发症，也是引起死亡一个因素[4]。目前，在哺乳动物中(如小鼠，雪貂)对病毒性肺炎进行了大量的研究[5]，但这些结论不能直接外推至人类。

为此，我们用H5N1 病毒感染恒河猴，建立非致死性流感病毒性肺炎模型，从临床症状、病毒复制、病理变化及免疫反应进行全面系统考察，为深入了解人感染H5N1病毒的发病机制提供依据。

1 材料与方法

1.1动物 中国恒河猴5只，年龄2.5～3周岁，平均体重(3.4 ± 0.2)kg，由广东省高要市康达实验动物技术有限公司提供，随机编为1～5号。染毒前，均用ELISA方法检测血清中H5N1禽流感病毒特异抗体均阴性，并提前进入生物三级安全实验室适应饲养5d后饲养于生物安全实验室的负压隔离器中。样品处理均在生物安全柜中操作。

1.2病毒制备 A/Goose/Guangdong/NH/2003(H5N1)由华南农业大学禽病研究室惠赠并经中国农科院哈尔滨兽医研究所鉴定。经多次在鸡胚中传代增殖，将血凝效价为1∶256的病毒液分装，置-80℃贮存备用，于动物实验前测TCID50为10-4.825/mL。

1.3病毒接种 实验前恒河猴麻醉后将体温芯片植入其颈部后方、肩胛骨上方的背中线位置，用数据收集器扫描芯片来测量猴的体温，观察是否出现流感相关症状和体征，每天2次。感染前按照0.2 mL/kg氯胺酮肌肉注射麻醉恒河猴后，经鼻向1～4号恒河猴滴入H5N1病毒液2 mL。用同样的方法给5号恒河猴注射等量的生理盐水，作为非感染对照组。1～5号猴分别在染毒后第1 d、3 d、6 d、14 d、1 d经颈动脉插管放血的方法剖杀。

1.4血液学和流感的特异抗体检测 在感染后第0 h、12 h、1 d、2 d、3 d、4 d、6 d、10 d、12 d和14 d，用EDTA-k2抗凝管从贵要静脉抽取2 mL外周血标本。用细胞动力学1200分析仪 (Abbott Laboratories,IL) 进行外周血液分析。检测流感病毒特异性抗体，用受体破坏酶进行预处理(消除红血球凝聚抑制剂)，然后用血清凝集抑制或血清中和试验进行鉴定。

1.5病毒分离及滴定 病毒分离：取材包括气管支气管淋巴结、肺、心、肝，肾，大脑及小脑。取材后，标本经焦磷酸二乙酯(DEPC)水处理的离心管分装，于-80 ℃保存。取定量组织2 g，加入玻璃研磨器中研磨做组织匀浆，随后加入5倍量的灭菌生理盐水(含200 μg/mL链霉素、200 U青霉素)，制成乳剂后移入灭菌试管中，以5 000 r/min (离心半径8 cm)离心10 min，取上清液接种鸡胚。参照Yoshimoto[6]的方法进行病毒的鸡胚接种扩增和病毒血凝效价测定。

病毒滴定：将浓度为1×105个/mL的MDCK细胞加入96孔板，每孔200 μL，细胞形成单层后，用维持液稀释病毒，按10倍递减，从病毒材料原液至10-9，每个浓度8个复孔，细胞对照加维持液，放入37 ℃ 5%CO2细胞培养箱中孵育。倒置生物显微镜观察细胞形态：正常IvlDCK细胞星多边形，分布均匀，细胞间排列紧密：细胞病变效应(CPE)表现为细胞收缩、变圆，聚集成团。采用Reed-Mueneh 法[7]计算半数细胞培养物感染量(TCID50)，表示病毒的毒力。

1.6细菌分离和致病性分析 称取肺组织0.1 g加入PBS缓冲液1 mL做细胞均质。取100 μL 接种在琼脂平板，在37 ℃有氧条件下孵化48 h后，选择典型的菌落并在Luria-Bertani肉汤培养。随后在6 w大的 BALB/c小鼠腹腔内接种100 μL的扩增细菌。用16S rRNA 序列鉴定细菌的种类。

1.7病理及免疫组化 取材后，用10%福尔马林固定，石蜡包埋，常规HE染色。按照文献描述的免疫组化方法对切片行病毒抗原染色[8]。第一抗体为A型流感基质蛋白特异性单克隆抗体 (Serotec Ltd.,Oxford,UK)，稀释浓度为1∶100，二氨基联苯胺(DAB)显色，阳性细胞染色呈棕褐色。

2 结 果

2.1临床症状 感染前，恒河猴状态良好，无禽流感相关症状和体征。染毒后第1 d开始出现发热，食欲下降，精神状态下降，活动度明显减少，呼吸急促，鼻孔扇动，张口呼吸。感染后1～3 d最为严重，第6 d后逐渐减轻，第14 d时恢复正常。白细胞总数在感染后第1 d达到高峰，到第6 d开始下降，到14 d恢复正常。淋巴细胞数分别在感染后第1 d，6 d下降。5号猴未出现上述变化。在实验期间无恒河猴死亡。观察结果表明A/Goose/Guangdong/NH/2003(H5N1)能有效感染恒河猴并出现典型的临床症状，感染后第14 d恢复(图1)。

2.2禽流感病毒侵袭机体的特点 病毒分离及病毒滴定的结果分别见表1及表2。除1，2号恒河猴肺组织中分离出病毒外，其它恒河猴的肺、气管支气管淋巴结、心、肝、脾、肾、脑未分离出病毒。

2.3病理改变 见图2。

2.4免疫组化 见图3、表1。

图1临床症状及外周血白细胞、T淋巴细胞变化

从恒河猴感染前1 d到感染后第14d监测体温和呼吸(图A 和B)；外周血在恒河猴感染后0 h、12 h、1 d、2 d、3 d、4 d、6 d、10 d、12 d和14 d采集 (图C和D)。不同颜色曲线代表不同的恒河猴(见图A表示)。

Fig.1Changesofclinicalsymptoms,peripheralwhitebloodcellandTlymphocyte

The temperature and respiration of the rhesus from -1 day to 14 day after infection (A and B).

The changes of numbers of peripheral white blood cell and T lymphocyte after infection (C and D).

Peripheral blood was collected at 0,12 hours,1,2,3,4,6,10,12 and 14 days after infection.

Different color curves represent differents rhesus (A).

表1 感染后恒河猴组织样品的病毒分离及免疫组化

3 讨 论

本研究中成功建立了实验诱导恒河猴发生非致死的流感病毒肺炎的动物模型。研究结果发现恒河猴感染H5N1病毒，表现为急性起病，发热，呼吸急促，活动度明显减少，食欲下降。感染H5N1禽流感病毒的恒河猴在肺组织观察到病理变化。H5N1禽流感病毒急性感染期，肺组织病理表现为渗出及坏死性间质性肺炎，弥漫性肺泡损伤。免疫组织化学、病毒分离结果表明H5N1禽流感病毒只能在下呼吸道复制，提示H5N1禽流感病毒具有致命性但可能不易发生人传染人。

表2 呼吸道组织病毒滴定(log10 EID50/mL)

Note: / not found.

图2病理变化

A 感染后1 d，肺组织实变严重，大量红细胞和炎症细胞侵润及纤维素渗出 (HE,×100)；B 感染后第3 d，病变最为严重，肺组织实变严重，可见大量红细胞和炎性细胞侵润及纤维素渗出 (HE,×100)；C 感染后第6 d，肺泡壁增厚，II型肺泡上皮增生 (HE,×400)；D 感染后第14 d，肺组织恢复期表现，肺泡结构恢复，肺泡内和间质的炎症渗出物已部分被吸收，无出血 (HE,×200)；E 细支气管 上皮细胞坏死脱落，脱落至基底细胞层或基底膜，支气管腔中有坏死脱落的上皮细胞 (HE,×400)；F心脏 心肌细胞间结缔组织轻度淋巴细胞浸润(HE,×200)；G肾脏 肾间质毛细血管扩张、充血，间质水肿(HE,×400)；H脾脏淋巴小结生发中心明显，体液免疫活跃表现(HE,×400)；I肝脏肝窦增宽，肝细胞肿大、嗜酸性变性、空泡变性 (HE,×400)。

Fig.2Pathologicalchange

A--The 1st day after infection,pulmonary consolidation was serious,many red blood cell,inflammatory cell and cellulose effusion were observed;

B--The 3rd day after infection,pathological changes was the most serious,many red blood cell,inflammatory cell and cellulose effusion were observed (HE,×100);

C--The 6th day after infection,there were alveolar wall thickening and type Ⅱ alveolar epithelium cell proliferation;

D--The 14th day after infection,pulmonary consolidation and alveolus structures recovered,and inflammation effusion was partly absorbed and there was no hemorrhage (HE,×200).

E--Bronchioles and epithelial cells neorobiosis and desquamate to Basal cell layer or basilar membrane,neorobiosis epithelial cells in bronchial lumen were observed (HE,×400);

F--Heart,lymphocytes infiltration in connective tissue between myocardial cell were observed (HE,×200);

G--Kidney,there was telangiectasis,hyperemia and interstitial edema in renal interstitium (HE,×400);

H--Spleen,lymphatic nodule germinal center was obvious and humoral immunity was active (HE,×400);

I--Hepatic sinusoid widened and there were hepatocyte tumefaction,acidophilia degeneration and vacuolar degeneration.

图3免疫组化

A 5号恒河猴(对照猴)的肺组织未发现H5N1病毒抗原；B 1号恒河猴(感染后第1 d)肺组织H5N1病毒抗原表达阳性(箭头)；C 2号恒河猴(感染后第3 d)肺组织H5N1病毒抗原表达阳性；D 3号恒河猴(感染后第6 d)肺组织H5N1病毒抗原呈局部表达；E 4号恒河猴(感染后第14 d)肺组织未发现H5N1病毒抗原；F 2号恒河猴肺泡Ⅱ型细胞呈阳性染色；G 3号恒河猴肺巨噬细胞呈阳性染色。(图A～E 免疫组化×400；图F～G 免疫组化×200)

Fig.3Immunohistochemisty

A--H5N1 viral antigens was not found in lung tissue of rhesus no. 5;

B--Rhesus no. 1 (1st day after infection),H5N1 viral antigens was positive;

C--Rhesus no. 2 (3rd day after infection),H5N1 viral antigens was positive;

D--Rhesus no. 3 (6th day after infection),H5N1 viral antigens was positive;

E--Rhesus no. 4 (14th day after infection) ,there was no H5N1 viral antigens in lung tissue;

F--Rhesus no. 2,type Ⅱ alveolar epithelium cell was positive staining;

G--Rhesus no. 3,macrophage was positive staining;

Figures A to E (×400); Figures F,G (×200).

1997年在香港发生H5N1病毒直接感染人事件后，许多问题仍未清楚，尤其是那些有关为何这种病毒的致病性如此强。在本实验中，免疫组化结果表明病毒没有在肺外器官复制，这与之前在H5N1感染猕猴模型和人类研究中有限的可用数据一致。因此，结果提示病毒主要在恒河猴肺组织复制，未发生病毒血症或侵染肺外组织，H5N1感染的患者出现多器官功能障碍综合征不一定伴有肺外器官病毒复制。然而，H5N1感染的患者是否有肺外器官病毒复制的确切证据仍然很少。

识别受感染的靶细胞，对研究病毒传播起重要作用，但在实验感染动物模型和人类病例中产生了矛盾的结果。本实验以免疫组化的方法，发现在巨噬细胞和II型肺泡细胞有病毒抗原的阳性染色，而不在气管及支气管的纤毛上皮。结果与以往报道的H5N1病毒能在食猕猴气管及支气管上皮复制的结果相反[9]。 但本实验的数据与之前对人类病例研究的结果一致，即II型肺泡细胞是H5N1病毒复制的主要场所，而不是气管及支气管的纤毛上皮[10]。H5N1病毒在呼吸道复制的部位是决定病毒传播的一个重要因素。通过病毒对唾液酸识别和结合活性的研究发现，禽流感病毒和人流感病毒分别识别唾液酸不同结构的糖链作为受体，禽流感病毒优先结合于唾液酸2-3半乳糖(α-2,3 Gal)，人流感病毒优先结合于唾液酸2-6 半乳糖(α-2,6 Gal)，而且这种识别的特异性非常强[11]。Shinya等[12]报道人呼吸道组织切片从鼻腔至终末呼吸细支气管主要表达唾液酸α-2,6-Gal受体，除鼻腔黏膜个别上皮细胞偶尔表达唾液酸α-2,3-Gal受体外，其他部位缺乏唾液酸α-2,3-Gal受体，相反，下呼吸道的呼吸细支气管与肺泡之间连接部的非纤毛立方细胞以及肺泡细胞表达唾液酸α-2,3-Gal受体为主；同时人流感和禽流感病毒结合与感染实验支持上述流感病毒受体分布特点，表明禽流感病毒可在人下呼吸道感染、复制。

临床资料表明[13-14]，人禽流感轻症病例的外周血淋巴细胞无明显降低，而严重病例多数出现血液学的改变，外周血白细胞计数及淋巴细胞降低。本实验对恒河猴感染禽流感病毒后的外周血白细胞及淋巴细胞的动态变化分析发现：外周血白细胞总数及淋巴细胞出现短暂的下降，于第6 d后逐渐恢复到正常水平。淋巴细胞数与病情密切相关，外周血淋巴细胞数量过低或降幅过大都提示预后不良，尤其是出现淋巴细胞计数进行性下降时，提示病情较严重。

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