沙门菌Ⅲ型分泌系统组成与装配研究进展

陈 龙，孟庆峰，康元环，单晓枫，曹 亮，钱爱东

沙门菌(Salmonella)是属肠杆菌科，革兰氏阴性杆菌。其动物宿主广泛，可以引发人的食物中毒、胃肠炎、伤寒、败血症等疾病，还可感染多种动物使其发生败血症、组织局部炎症、胃肠炎、腹泻等，而怀孕的母畜感染沙门菌还可致其流产。沙门菌可以在多种动物间进行传播，因此是一种重要的人兽共患病病原。III型分泌系统(T3SS)广泛存在于多种革兰氏阴性菌中，它与病原菌毒力因子的分泌密切相关。而T3SS大多数由病原菌毒力岛(SPI)编码。目前，在沙门菌中发现的5种毒力岛中，SPI1和SPI2对沙门菌T3SS最为密切：SPI1编码的T3SS-1使沙门菌能够侵袭肠道上皮细胞；SPI2编码的T3SS-2对沙门菌在细胞内的存活起重要作用[1-2]。研究表明，沙门菌III型分泌系统只有当病原菌与宿主细胞接触后，这一系统才得以启动，并且沙门菌T3SS分泌的效应蛋白不在胞浆间隙中停留，也不被切割，直接从胞质输送到细胞表面，引起宿主细胞一系列反应，有利于病原菌在上皮细胞上定植[3]。随着研究的深入，人们发现，编码T3SS的许多基因与编码革兰氏阴性细菌的鞭毛输送装置基因具有一定的同源性[4]，一些学者开始对沙门菌T3SS的形状进行假设并通过透射电子显微镜方法绘制了其结构模拟图，同时对其各组成部分进行了研究。本文将对沙门菌T3SS的组成与装配作一介绍。

1 沙门菌 T3SS装置的组成

通过透射电子显微镜下观察，多种病原菌的T3SS装置的结构较为相似。KuboriT等曾绘制鼠伤寒沙门菌(Salmonellatyphimurium) T3SS的大概结构，其具有注射器形状，因此有研究者称之为针头复合物(needle complex, NC)或“注射器”[5]，现在统一规范其称作：T3SS注射装置(injectisome)[6]。近年来，研究人员通过透射电子显微镜观察、氨基末端测序、免疫印迹分析、PAGE等技术，纯化T3SS注射装置，并清晰的展示了各部分结构(图1所示)：该装置是大分子复合物结构，由跨越细胞膜的基体和从细胞外膜开始延伸的针样复合物组成，包含超过20种不同的蛋白亚基存在于膜的内部和外部、以及位于细菌细胞的周质和细胞质中。沙门菌通过T3SS注射装置分泌效应蛋白，并有利于病原菌在宿主细胞内定植[7-8]： Ehrbar等敲除沙门菌野生菌SL1344的毒力岛，由其编码的T3SS注射装置分泌的效应蛋白缺失，致使沙门菌入侵体外培养细胞的能力大为减弱[9]。

1.1沙门菌T3SS装置的主要组成 T3SS注射装置基体部包括横跨细菌内膜和外膜的内环和外环，其间是楔形的颈部，基体部长约30 nm。针状结构是注射装置的核心，起始于细菌外膜并向外延伸，长度大约为50 nm，是一种中心中空的筒型管道，研究表明，该管道能够通过直径为25 A°的效应蛋白[10]。易位器是由T3SS注射装置分泌的一种保守蛋白质，T3SS注射装置针状结构的针尖部位可以与易位器相互接触，效应蛋白通过易位运动到达真核细胞膜上，并形成孔隙，使效应蛋白进入真核细胞内，以达到入侵宿主细胞的目的[11-12]。

1.2沙门菌T3SS装置的辅助蛋白 研究发现，T3SS注射装置还需要一些附属蛋白进行协助，其中具有调控功能的胞浆复合物位于基体部，可以识别效应蛋白，例如运输ATP酶(ATPase)，它是一种运输蛋白，能够水解ATP，ATPase连接基体底部，为T3SS输出装置提供能量并促进分泌系统分泌[13]。Lostroh等通过对S.typhimuriumT3SS注射装置进行研究表明，这种具有调控功能的复合物能够调控分泌系统上基因在宿主内的表达，协调分泌装置的装配过程；同时还证实了该复合物不仅由毒力岛SPI-1编码，还可由染色体编码[14]。

III型分泌系统输送效应蛋白通常还需要分子伴侣的帮助。分子伴侣是酸性、小的、位于细胞质膜的附属蛋白，由InvB、SicA、SigE、Sicp等蛋白组成，它能够增强分泌效率，帮助特定效应蛋白的易位。例如，SicA可引导分泌蛋白进入转位机制或阻止蛋白在分泌前降解。另外，分子伴侣能够调控效应蛋白在细胞质中的浓度效应来影响转录。

2 SPI-1 T3SS装置的装配

目前研究认为，III型分泌系统只有与宿主细胞接触后才能启动III型分泌系统，注射装置才能被激活、装配、形成。注射装置主要由异源多蛋白或其复合物构成，主要包括PrgK、PrgH、InvG、PrgJ、SipB、SipC、SipD等蛋白。

图1 沙门菌T3SS注射装置结构

Kimbrough等对沙门菌注射装置的装配进行了总体概括，其装配途径分为两个时期：首先，组成基体部位的PrgH/PrgK和InvG蛋白被派送到细菌内膜和外膜上，并进行自我装配，形成内环外环等基体部结构，此时，调控复合物和分子伴侣与基体部相互结合，分泌底物蛋白；之后，针状组件(PrgI, PrgJ)进行装配，同时分泌InvJ蛋白，切换特异性分泌装置进行分泌易位器蛋白和效应蛋白，易位器装配形成，分泌效应蛋白进入宿主细胞。

2.1基体的装配 基体部是注射装置的基座，很多学者认为只有基座装配好，才能向外延伸形成针状结构。Schraidt等研究发现，内环部分是由24个亚单元PrgK和PrgH蛋白组成[15]。PrgK/PrgH是具有脂蛋白的结构修饰单元，编码这些蛋白的基因位于prgHJK启动子内，这个启动子在细菌的内化和蛋白分泌过程中具有重要作用。另外，Moest等通过研究调查发现，内环上还有InvALN、SpaP、SpaQ、SpaR、SpaS蛋白[16]，其中，SPaP、SpaQ和SpaR蛋白有跨膜的疏水区，它们都有两个以上的TM片段(疏水区)。

外环和颈部是由15个InvG拷贝组成[17]，这些蛋白汇成一个楔形结构并且具有两个α折叠和一个β-折叠，这个组成对内环和外环的形成有关键性的作用[18]。InvG蛋白是PulD蛋白家族的一员，也是唯一与III型分泌系统分泌的蛋白具有同源性的蛋白，然而，同源性仅限制在蛋白的C区，该区在将蛋白定位到外膜方面具有重要的作用。研究还发现，InvG不仅是形成外环的主要蛋白，同时可以延伸到周质中对内环的形成也有直接关系。也有报道称外环的主要蛋白还包括InvH，该蛋白可以促使沙门菌粘附并侵入上皮细胞。

注射装置的针状结构与由PrgJ蛋白组成的内杆部分相连，这个亚结构横跨基体部分，并控制针状结构的长度[19]。沙门菌III型分泌系统内杆中蛋白质PrgJ是部分折叠的。

2.2针状结构装配 通过对针状结构的分析，发现它只含有一种PrgI蛋白，由两个平行的α螺旋组成，α1-α1和α2 -α2的相互作用有利于其中均聚物的聚合和一个右手螺旋的形成，这个结构类似于鞭毛丝的装配。此外，PrgI同源蛋白还广泛存在于动物致病细菌Ⅲ型分泌系统中，但在植物病原菌中却没有发现。

针状结构和针尖部分结构上具有一些差异，针状结构的针尖是由5个SipD分子组成。通过该蛋白的α螺旋的构象变化与PrgI相互作用，输送效应蛋白进入宿主细胞[20]。虽然，III型分泌系统与鞭毛结构具有一定的同源性，可能会有一些相似性，但是T3SS的针状结构在装配过程中会发生构型变化并且更有利于固定。Thomas等发现PrgJ和针状结构提供了底物特异性转换的基础平台[21]。随着基体组件(PrgH, PrgK, InvG)和输出装置的装配之后，按照组件分泌的顺序，注射装置的针状物起源于外膜InvG顶端并向外突出的装置结构。有这样一种假设，针状结构可能在基体内部早就开始进行装配并起始于内环。但是，Sukhan等通过机械破坏沙门菌注射装置的外膜，观察到内环部位直接与一个内杆部位相连，并且内杆部分又与针状结构相互联系[22]。此外，Anan等对其进行深入研究表明，如果外环的主要蛋白InvG消失的话，主要的针状蛋白PrgI仍然和基体复合物相连，所以InvG的缺失几乎不影响针状结构的装配和形成[23]。在大多数情况下，针状结构的完整装配对易位器结构的形成至关重要。

2.3易位器装配 研究表明，易位器主要由SipB，SipC蛋白组成，其与针尖的SipD共同作用致使宿主细胞上面孔径的形成，这些蛋白对所有效应蛋白注入细胞膜内是必不可少的[24]。通过观察发现，SipB 和SipC插入细胞膜内形成一个多聚易位复合物，这个过程可能由针尖上面的SipD蛋白控制。通常情况下，标准的易位过程是从细菌到宿主细胞的胞浆内，但也有从一个细菌易位到另一个细菌的胞浆中的情况，这种现象在假结核耶尔森氏菌(yersiniapseudotuberculosis)的效应蛋白YopH和沙门菌(Salmonella)中都有发现[25]。

最近实验发现，SipB蛋白可直接结合胆固醇并启动易位器的装配[26]。胆固醇在宿主细胞膜上大量存在，但在细菌的膜中含量很少，SipB和胆固醇的相互作用能提高T3SS-1易位器的装配效率并有助于沙门菌入侵宿主细胞[27]。Patel等研究发现，Salmonella与宿主细胞膜接触后，易位器的易位孔装配形成，首先进入的效应蛋白调控膜皱裂、细菌内陷使T3SS-1上更多的注射装置激活，效应蛋白注射增多[28-30]。效应蛋白在最初阶段较少，随着更多注射装置与宿主细胞接触，使效应蛋白成线性增长，介导细菌入侵，一旦进入宿主细胞后，沙门菌就会进行负调控T3SS-1的表达[31]。

3 结 论

通过对沙门菌III型分泌系统的研究后发现，沙门菌注射装置是一种病原细菌向宿主细胞内靶向转运毒力蛋白的投递系统，介导入侵细胞，有利于细菌定植，是细菌病原与宿主相互作用的重要致病机制，同时，也是入侵宿主细胞的重要工具。由此给我们提供了许多可以探究的问题和新的研究方向，例如用III型分泌系统输送异源蛋白质，可能会发展出新的疫苗和治疗方法，III型分泌可能为定向输送工程蛋白、影响细胞信号转导等提供有用的工具。

此外，学者们对III型分泌系统的结构和装配进行了初步的研究，虽然对注射装置有了基本上的了解，但目前有些蛋白的存在仍不清楚：例如InvH蛋白是否对于外环结构是必不可少的，是否还有其他蛋白对于结构的组成起到关键作用；沙门菌T3SS-2形态也类似于注射装置，但其结构组成报道较少，因此，两种注射装置的组成是否具有相关性，它们之间的调控和联系具体怎样，还需要继续研究探索。

目前，对于如何预防注射装置也是一个热门的领域，专门抑制T3SS注射装置的新型药物和疫苗，具有广大前景。现今，T3SS注射装置的疫苗已开发，如应用大肠杆菌O157∶H7中的T3SS分泌蛋白鼻内免疫小鼠能阻止大肠杆菌O157∶H7的定居[32]，这些相关疫苗和药物等研究都已经陆续开展，我实验室也通过对沙门菌T3SS注射装置的分泌蛋白进行研究，寻找疫苗和药物抑制沙门菌在宿主细胞上的定植，希望能为预防和治疗抗感染提供新的治疗方法。

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