年龄对小鼠继发性肝泡状棘球蚴模型的影响

夏海洋，赵阶峰，王其昆，李 立，唐景霞，张示杰，彭心宇，杨宏强

泡状棘球坳病(Alveolar Echinococcosis, AE)是由泡状棘球蚴绦虫幼虫(Echinococcusmultilocularis,E.m)引起的一种人兽共患寄生虫病。主要在寄生于肝脏，可通过血行、淋巴、浸润和种植等途径转移至脑或肺等器官[1]，危害性极大[2]，不经治疗的患者10年的死亡率可达93%[3]。选择合适的动物制作继发性肝泡状棘球蚴模型是研究此病的基础。灰仓鼠[4]，大鼠[5]均作为泡球蚴保种动物，长爪沙鼠由于肝脏平均感染率高可以作为理想的实验性肝泡球蚴动物模型[6]。然而，灰仓鼠、长爪沙鼠却因在国内只有新疆和大连的少数实验动物中心能够提供，限制了其作为动物模型的应用。课题组前期利用昆明鼠制作肝泡状棘球蚴病模型，发现肝脏感染率在70～80%之间，提示昆明鼠可作为理想的实验性肝泡状棘球蚴动物模型。关于建立泡状棘球蚴模型动物的方法及造模动物的选择之类的文献较多，但选取的造模动物的年龄却参差不齐，未给出合适的年龄范围。Burlet[7]等人的调查发现鼠的年龄与泡状棘球蚴的感染率有关，年龄小的田鼠(Arvicola terrestris)的泡状棘球蚴感染率低于年龄大的田鼠。本研究通过制作不同的年龄的昆明小鼠原发性肝泡状棘球蚴模型，并置于室温18～22℃、湿度50～60%、光照充足的环境下饲养，探讨不同年龄对小鼠继发性肝泡状棘球蚴病模型的影响。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1种鼠 28周龄灰仓鼠(E.m保种20周)2只，体重为67 g、75 g, 来源于新疆自治区疾病控制中心。

1.1.2实验小鼠 8周龄、18周龄、28周龄雌性昆明小鼠分别为29、25、25只，购于新疆自治区疾病控制中心。

1.2方法

1.2.1制配20%E.m组织混悬液 无菌条件下取出种鼠腹腔内E.m组织，无菌PBS液(加青霉素和链霉素250 IU/mL)漂洗3次，剪碎、研磨、过筛，无菌PBS液冲洗沉淀3次，配成20%的混悬液，0.5%伊红染色高倍镜下可见E.m原头节1～3个/视野，结构清晰，着色率<15%。

1.2.2动物麻醉及接种 天平称量小鼠体重，消毒小鼠腹部皮肤，按照4 mL/kg, 腹腔注射20%乌拉坦，待麻醉后，小鼠固定于手术台，0.5%的碘伏消毒腹部术区皮肤，75%的酒精脱碘，按照课题组前期的方法[8]，采取切开上腹部皮肤经腹壁肌层透视下肝穿刺接种，将20%E.m组织混悬液以0.1 mL/只的剂量注射于小鼠肝脏，退针后穿刺点局部按压防止肝脏出血，3-0非吸收性外科缝线间断缝皮。接种过的小鼠禁食水、电暖气复温12 h，复温后置于室温18～22℃、湿度50～60%、12 h光照的环境饲养，饲养密度为5只/笼。

1.2.3观察指标

1.2.3.1分别统计各组小鼠存活率及术后3 d内、3 d之后的死亡原因。

1.2.3.2接种100 d(14周)后将小鼠实行安乐死并解剖，统计肝脏E.m感染率、肝脏E.m包囊的直径及质量。

1.2.3.3石蜡包埋肝脏E.m组织并切片，苏木素-伊红(HE)染色观察。在普通光镜下观察肝泡状棘球蚴的病理组织学改变，根据泡状棘球蚴角质层、生发层病理形态改变及育囊和原头蚴发育情况分为以下3级：

0级:泡状棘球蚴基本结构正常, 其生发层和角质层基本结构清晰，可见生发层细胞增殖明显, 大部分可见育囊、芽生等结构结构, 育囊内可见不同数量的泡状棘球蚴原头节及头节钙颗粒。该级基本结构正常。

Ⅰ级:虽存在泡状棘球蚴结构而且能够辨认角质层及生发层, 但肿胀以及变薄等变性变化普遍存在, 且部分生发层、角质层发生断裂，囊泡塌陷, 育囊、原头蚴很少见。该级以变性改变为其主要变化。

Ⅱ级:失去正常的泡状棘球蚴结构, 角质层及生发层变性普遍，常见生发层角质层的断裂、分离及脱落, 生发层细胞核固缩、溶解或消失，基本上见不到育囊和原头蚴，钙颗粒偶见且基本结构形态模糊。重者难以辨认角质层及生发层，或呈现大泡状坏死及纤维组织增生和炎性细胞浸润。该级以变性、坏死性改变为其主要变化。

2 结 果

8周龄、18周龄、28周龄小鼠的存活率分别为：62.1%、84%、68%(P>0.05)。术后3 d内死亡分别为：3/29(10.3%)、1/25(4%)、3/25(12%)。死亡原因为：8周龄组3只均死于术后肠梗阻，18周龄组1只死于肝出血，28周龄组2只死于术后肠梗阻、1只死于肝出血。术后3 d后死亡分别为：8/29(27.6%)、3/25(12%)、5/25(20%)。死亡原因为：8周龄组2只死于肠梗阻、3只咬伤死亡、3只原因不明(解剖未见异常)，18周龄组1只死于肠梗阻、1只咬伤死亡、1只原因不明，28周龄组2只死于肝硬化腹水、2只咬伤死亡、1只原因不明(表1)。3组小鼠肝脏E.m感染率分别为：72.2%、71.4%、76.5%(P>0.05)。3组小鼠肝脏E.m包囊直径分别为：0.915±0.103 cm、1.247±0.112 cm、1.215±0.197 cm(P>0.05)(图1)。3组小鼠肝脏E.m包囊质量分别为：0.332±0.035 g、0.532±0.155 g、0.382±0.085 g(P>0.05)(表2)。3组小鼠肝E.m组织HE染色均为0级：生发层和角质层基本结构清晰，基本结构正常(图2)。

表1 术后3 d内及3 d后小鼠死亡原因分析

图1各实验组离体肝泡状棘球蚴组织

Fig.1ExsomatizedhepaticE.mtissueindifferentexperimentalgroups

A:8 weeks; B: 18 weeks; C: 28 weeks

图2各实验组肝泡球蚴组织HE切片(200倍镜)

Fig.2Hepaticechinococcalcystindifferentexperimentalgroups(HEstain,×200)

A:8 weeks;B:18 weeks;C:28 weeks

表23组小鼠肝脏E.m感染率、E.m直径(cm)、质量(g)

Tab.2Infectionrate,diameterandmassofhepaticE.mtissueinthreedifferentagegroups.

Group Infection rates Diameter (x±s cm) Mass (x±s g) 8-week-old 72.2% 0.915±0.103 0.332±0.03518-week-old 71.4% 1.247±0.112 0.532±0.15528-week-old 76.5% 1.215±0.197 0.382±0.085P>0.05 >0.05 >0.05

3 讨 论

建立肝泡状棘球蚴模型是药物、影像、免疫等研究的基础，目前建立肝泡状棘球蚴模型的常见方法有开腹肝穿刺接种和经皮肝穿刺接种，开腹肝穿刺存在着术后肠梗阻[9]和感染风险[10]，实验条件要求高，操作复杂等。经皮肝穿刺接种肝脏感染率低，且易误穿胸腔[8]。卞致远等[8]研究表明，切开上腹部皮肤经腹壁肌层透视下肝穿刺(简称：切皮肝穿刺)，在肝脏E.m感染率上与传统的开腹肝穿刺相当，并有操作简便、后期并发症低等优点。因此，本研究采取本课题组前期的新型肝穿刺方法制作不同年龄的小鼠继发性肝泡状棘球蚴模型。

肝泡状棘球蚴模型动物以鼠为主，但是对于鼠的年龄范围的选取却没有统一标准。Burlet[7]等人结果发现，泡状棘球蚴感染率与鼠的年龄相关，但结论分析认为，由于泡状棘球蚴虫卵耐寒冷及鼠的活动呈现季节性，所以那些过冬的大龄鼠在冬天已经获得了感染，导致这些老鼠在来年的春天出现了泡球蚴的高感染，因此，他们认为泡球蚴的感染率与年龄之间并没有密切的关系。本实验剔除温度、湿度、气候等影响后发现，3组不同年龄的小鼠的肝脏E.m感染率、肝脏E.m包囊直径、质量均无统计学差异(P>0.05)，提示年龄对昆明小鼠肝脏泡状棘球蚴感染率并无差异。饲养100 d后3组小鼠的存活率分别为：62.1%、84%、68%(P>0.05)，3组年龄段的小鼠存活率之间并无差异。病理HE染色结果示：不同年龄的小鼠肝脏E.m的角质层、生发层结构评论等级并未出现差异。提示较大年龄的昆明小鼠亦可作为肝泡状棘球蚴病模型小鼠，用于制作肝泡状棘球蚴病模型的昆明鼠不局限于某一年龄段。虽然3组小鼠在存活率上无统计学差异，但18周龄小鼠存活率(84%)高于8周龄(62.1%)、28周龄(68%)，存在一定的趋势，若能扩大接种小鼠的样本量，存活率上18周龄小鼠与另两组相比或许会存在统计学差异。存活小鼠的数量对于整个实验至关重要，否则会造成样本量不足，影响实验的可行性。若是单纯扩大接种小鼠的数量，不但会增加实验成本，而且会违背“尽可能合理地使用动物以减少实验动物的使用数量”这一原则。

术后3 d内死亡的小鼠：8周龄组3只小鼠均死于肠梗阻，28周龄组2只小鼠死于肠梗阻，提示年龄较小或较大的小鼠的重要脏器发育不全或者代偿功能下降[11]，对麻醉药物的代谢、清除减慢，后期麻醉复苏困难，从而易引起心肺功能抑制、胃肠蠕动麻痹等导致死亡。术后3 d后死亡的小鼠：8周龄组8只小鼠，18周龄组3只小鼠，28周龄组5只，昆明鼠喜群居饲养，难免产生撕咬、打斗导致死亡。3组小鼠均存在无法寻找原因的死亡例数(解剖后未见明显异常)，昆明小鼠对环境适应性较差，不耐热，不耐饥饿，对疾病抵抗力低，对外界刺激十分敏感[12]，这些无法寻找原因的死亡例数很可能与饮食、饲养环境的温度、湿度的轻微变化有关。其中28周龄组中2只死于肝硬化腹水，提示年龄过大的小鼠在接种E.m后，较其它年轻小鼠易引起肝脏器质性疾病，这可能与26周之后，肝脏开始出现衰老迹象[13]有关，肝脏器质性疾病对小鼠的存活影响极大，并且明显干扰小鼠血清生化等检测指标。

综上所述，年龄虽对昆明小鼠肝脏E.m感染率，肝脏E.m包囊直径、质量及肝泡球蚴组织病理学并无影响，但18周龄小鼠的存活率较其它两组高，且术后3 d内并无小鼠因麻醉药物耐受性差而导致肠梗阻死亡，提示18周龄小鼠对于麻醉药物的耐受性强于其它两组老鼠，对小鼠后期复苏有利。术后3 d后18周龄小鼠未出现肝脏器质性疾病，提示18周龄小鼠肝脏既能感染泡球蚴，又能耐受泡球蚴，而不至于产生影响肝功能的肝脏器质性疾病而干扰实验。所以，利用18周龄小鼠作为造模动物制作继发性肝泡状棘球蚴模型，实验小鼠存活率高。

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