中缅边境恶性疟原虫Pfcrt基因76位点突变研究

邓 艳,王珊珊,董 莹,王 剑

疟疾为WHO重点关注的6大热带病之一，广泛分布于北纬60°～南纬30°之间的热带、亚热带以及部分温带地区。2011年，全球99个国家报告了26万确认的疟疾病例，10万多人死于疟疾。全球有3.3亿人处于感染疟疾的高风险下。云南省疟疾病例主要集中于保山市和德宏州，以输入性恶性疟主，据统计，2009—2011年恶性疟病例1 619例，其中318例为来源于缅甸的外籍病例。与中国云南省德宏州盈江县那邦镇接壤的缅甸克钦邦第二特区的一个名为拉咋的小城市，位于北纬24°45′24″，东经97°33′47″，海拔263 m，当地经济落后，政局不稳，主要经济作物为香蕉，同我国云南尤其德宏州盈江县边民往来频繁，无可避免地影响了我省的疟疾防控。

经检测显示中缅、中老边境地区恶性疟原虫对氯喹普遍具有高度抗性，中部地区也有约50%的原虫对该药产生了抗性[1]。20世纪80年代以来疟原虫对青蒿素类药物敏感性也明显下降[2]。近年对氯喹抗性产生的分子机制研究发现，恶性疟原虫氯喹抗性基因pfcrt片段的扩增及点突变与氯喹抗性的产生有关[3]，即使现场与实验室研究结果不完全一致，但相关研究都肯定该基因与氯喹抗性有关[4-5]。

Fidock[6]等发现Pfcrt位于恶性疟原虫7号染色体上，有13个外显子，并与cg2基因紧密连锁，编码恶性疟原虫氯喹转运蛋白(pfcrt)，该蛋白也是恶性疟原虫食物泡膜结构蛋白的组成部分，具有氯喹转运载体功能。Fidock等[6]建立PCR/RFLP方法检测pfcrt基因76位点突变的方法。研究发现，全部抗性株的pfcrt都在第76位氨基酸发生了K-T的突变，即由野生型赖氨酸(Lys)突变为苏氨酸(Thr)时，氯喹易化扩散进入疟原虫食物泡内的效能下降，疟原虫可表现为对氯喹有抗性；而敏感株无突变，由此认为恶性疟原虫的CQR表型可能有pfcrt基因76号氨基酸编码突变决定。

鉴于国内近年来对恶性疟原虫氯喹抗性相关基因的研究较少，本研究应用巢式PCR/RFLP方法对云南省中缅边境地区的恶性疟原虫相关抗性基因pfcrt进行了初步的流行病学研究，以了解该基因目前在中缅边境恶性疟中的情况。

1 材料与方法

1.1试剂和仪器 DNA提取试剂盒为QIAamp公司(德国)的DNA Mini Kit(51304)，Taq 酶为天根生化公司的2×PCR Mix试剂盒，上样缓冲液为TaKaRa 6×Loading Buffer，琼脂糖为Biowest Regulav AgaroseG-10(lot:11860)。基因扩增仪为杭州博日科技有限公司的TC-96/G/H(b)。电泳仪ELITE300为WEALTEC公司产品，凝胶成像系统Gel Doc XR+为BIO RAD公司产品。

1.2血样采集 恶性疟原虫血样采集地点位于中缅边境地区的云南省盈江县那邦镇和缅甸拉咱市，对显微镜确诊的恶性疟现症病例采集耳垂血并制作成滤纸血滴，干燥、防虫保存。

1.3基因组DNA制备 使用QIAamp公司的DNA提取试剂盒DNA Mini Kit，按照操作说明提取基因组DNA，保存于-20℃。

1.4目的基因片段的扩增 根据文献[7]合成引物，分别以表1引物及条件进行两轮PCR扩增，扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳、BIO RAD凝胶成像系统分析。

表1 pfcrt基因巢式 PCR扩增引物序列及反应条件

PCR反应体系：2×PCR mix混合液25 μL，正向引物(20 μmol/L)0.5 μL，反向引物(20 μmol/L)0.5 μL，第一轮DNA模板3 μL,第二轮以第一轮扩增产物为模板2 μL，去离子水补足体积至总体积为50 μL。

1.5限制性内切酶分析和结果判定 限制性内切酶反应总体积为16 μL，其中，含第二轮PCR扩增产物5 μL、Apo I限制性内切酶1 μL、10×Apo I Buffer缓冲液1 μL，不足部分用去离子水加至16 μL。50 ℃水浴消化过夜。酶切产物经2%琼脂糖凝胶电泳、Biao-Rad凝胶成像分析。

经RFLP后，若出现149 bp、21 bp(2%琼脂糖凝胶电泳不可见)条带组合为Pfcrt基因76位点编码为突变型，指示恶性疟原虫对氯喹有抗性；若出现93 bp、51 bp(2%琼脂糖凝胶电泳不可见)组合则为Pfcrt基因76位点编码为野生型，提示恶性疟原虫对氯喹无抗性；若同时出现上述多条带者表明Pfcrt基因76位点编码突变型和野生型混合存在，仍提示恶性疟原虫对氯喹有抗性[4]。

1.6测序及76位点编码基因型分析 选取Pfcrt基因PCR扩增阳性的样本进行测序，以内侧上、下游引物为测序引物进行双向测序，测序结果在NCBI进行BLAST比对，AAA为pfcrt等位基因第76位编码密码子野生型，存在1个ApoI酶切位点；ACA为突变型，不存在ApoI酶切位点。

2 结 果

2.1巢式PCR扩增 对158份恶性疟现症病人血样经巢式PCR扩增含有第76位氨基酸的Pfcrt基因片段，其中有117份样本被扩增出目的基因片段，片段大小为145 bp，如图1所示，检出率为74.05%(117/158)。

图1巢式PCR扩增恶性疟原虫pfcrt基因结果

M ：分子标准， P：阳性对照，1-2：阴性样本，3-5：阳性样本

Fig.1ResultsofnestedPCRamplificationofpfcrtgene

M: Marker; P: Positive control; 1-2: Negative sample; 3-5: Positive sample.

2.2RFLP分析 对出现PCR扩增阳性的117份产物进行限制性内切酶分析，其中112份的酶切产物为150 bp、21 bp片段组合，即112份血样的Pfcrt基因76位点编码为突变型，突变率为95.73%(112/117)，见图2。5份为野生型 。

图2pfcrt基因扩增和K76T点突变酶切电泳结果

Fig.2ElectrophoresisresultofpfcrtgeneandK76Tmutationgene

2.3序列测定分析 105份Pfcrt基因PCR扩增产物的双向测序结果及AAA、ACA序列位置如图

3、4所示，突变型和野生型基因的blast比对如图5所示。野生型pfcrt等位基因第76 位编码密码子为AAA，在该段扩增序列中存在一个ApoI酶切位点, 而突变型pfcrt等位基因密码子为ACA, 在该段序列中就不存在该酶切位点,序列测定结果与酶切结果一致。

图3 野生型pfcrt等位基因序列图

图4 突变型pfcrt等位基因序列图

2.4RFLP与测序结果的对比分析 102份同时经测序和RFLP酶切分析的样本，除2份测序结果显示为野生型，而酶切结果显示为突变型外，其余100份样本序列测定结果与酶切结果一致。两种方法经配对X2检验，P>0.05，差异无统计学意义。

图5 野生型和突变型pfcrt等位基因blast比对结果

Tab.2Comparativeanalysisonthemutationatcodon76ofpfcrtgene

RFLPSequencingAAAACATotal150/2311293/51298100Total399102

3 讨 论

Pfcrt位于恶性疟原虫7号染色体上，36 kb大小，含有13个外显子，编码氯喹抗性转运蛋白，该蛋白位于消化泡膜上，pfcrt发生的点突变可能影响氯喹在食物泡中的富集，或可影响膜两侧的离子交换从而影响氯喹富集所需的PH值而产生对氯喹的抗性。研究发现Pfcrt存在8个密码子变异，它们分别位于72、74、75、97、220、271、326、356和371位点，但K76T是与氯喹抗性关系最为密切的。

本文以董莹[7]等的方法合成引物对恶性疟原虫病人的血样进行pfcrt基因76位点进行PCR扩增，扩增成功率为74.05%(117/158)，低于董莹[7]、王安平[8]、官亚宜[9]、杨亚明[10]等的研究结果，影响检出率的最大因素可能与样本采集时血量不够及采样时间和检测时间间隔过长有关。

同时用RFLP和序列测定两种方法研究pfcrt基因76位点的突变。结果显示，RFLP检测中缅边境地区pfcrt基因76位点的突变率为95.37%(112/117)，这一结果与董莹[7]和杨亚明[1]等对云南省恶性疟pfcrt基因K76TD的研究结果基本一致(K76TD的突变率分别为94.12%和85%)，抗氯喹恶性疟的检出率也与杨恒林[2]等采用体外微量法的检出结果符合，但95.37%的pfcrt基因76位点突变率高于王安平[8]和官亚宜[9]对海南省恶性疟原虫的45.16%和64.3%突变率。测序方法分析pfcrt基因76位点的基因型显示，突变率为97.06%(99、102)，略高于RELP分析结果，两者结果的不一致，可能由于测序过程中的碱基错配形成，但两者无显著统计学差异，因此即使两者结果不一致，仍然不影响最终结果的判定。

本文结果提示Pfcrt可以作为云南省监测恶性疟对氯喹抗性的分子标志之一。还提示从1994年以来，云南省中缅边境的氯喹抗性在pfcrt基因水平无改变，只是检测的实验不多。而国内外资料表明：即使存在K76T突变的恶性疟原虫株仍有可能对氯喹敏感[11]，因此尚不能轻易作出云南省中缅边境氯喹抗药性仍普遍存在的结论。今后应作更多的检测。

参考文献：

[1]Yang YM, Zhang ZX, Zhou S, et al. Study on 76 point mutation of chloroquine resistance transmembrane transporter gene inPlasmodiumfalciparumin Yunnan province[J]. Chin J Parasit Dis Ctrl, 2005, 18(5): 365-367.(in Chinese)

杨亚明, 张再兴, 周升, 等. 云南恶性疟原虫氯喹抗药性基因 76 位点突变研究[J]. 中国寄生虫病防治杂志, 2005, 18(5): 365-367.

[2]Yang HL, Liu DQ, Huang KG, et al.Invitrosensitivity ofPlasmodiumfalciparumto derivatives of Artemisinin, Pyronaridine and Chloroquine in Yunnan of atremisinin[J]. Chin J Parasitol Parasit Dis, 1997, 15(5): 292-296.(in Chinese)

杨恒林, 刘德全, 黄开国, 等. 云南省恶性疟原虫对青蒿素类药物及咯萘啶与氯喹敏感性的体外测定[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 1997, 15(5): 292-296.

[3]Su X, Kirkman LA, Fujioka H, et al. Complex polymorphisms in an 330 kDa protein are linked to chloroquine-resistantP.falciparumin Southeast Asia and Africa[J]. Cell, 1997, 91(5): 593-603. DOI: 10.1016/S0092-8674(00)80447-X

[4]Djimde A, Doumbo OK, Cortese JF, et al. A molecular marker for chloroquine-resistant falciparum malaria[J]. N Eng J Med, 2001, 344(4): 257-263.

[5]Durand R, Jafari S, Vauzelle J, et al. Analysis of pfcrt point mutations and chloroquine susceptibility in isolates ofPlasmodiumfalciparum[J]. Mol Biochem Parasitol, 2001, 114(1): 95-102. DOI: 10.1016/S0166-6851(01)00247-X

[6]Fidock DA, Nomura T, Talley AK, et al. Mutations in theP.falciparumdigestive vacuole transmembrane Protein PfCRT and evidence for Their role in chloroquine resistance[J]. Mol Cell, 2000, 6(4): 861-871. DOI: 10.1016/S1097-2765(05)00077-8

[7]Dong Y, Zhang ZX, Adagu IS, et al. Detection of polymorphism ofPlasmodiumfalciparumchloroquine resistant gene 76 codon by nested PCR/RFLP[J]. J Pract Parasit Dis, 2001, 9(3): 104-106.(in Chinese)

董莹,张再兴, Adagu IS, 等. 套式PCR检测恶性疟原虫Pfcrt基因76号编码多态性及RFLP分析[J]. 实用寄生虫病杂志, 2001, 9(3): 104-106.

[8]Wang AP, Gao Q, Gu YP, et al. Study on the haplotypes of pfcrt polymorphis from Hainan province[J]. Chin J Parasitol Parasit Dis, 2007,25(2): 106-108.(in Chinese)

王安平, 高琪, 顾亚萍, 等. 海南恶性疟原虫 pfcrt 等位基因多态性的单体型研究[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2007,25(2):106-108.

[9]Guan YY, Tang LH, Hu L, et al. The point mutation in Pfcrt and Pfmdr1 gene in Plasmodium falciparum isolated from Hainan province[J]. Chin J Parasitol Parasit Dis, 2005, 23(3): 135-139.(in Chinese)

官亚宜, 汤林华, 胡铃, 等. 海南恶性疟原虫分离株 Pfcrt 和 Pfmdr1 基因点突变的研究[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2005, 23(3): 135-139.

[10]Yang HL, Liu DQ. Longitudinal surveillance of chloroquin resistance of Plasmodium falciparum after cessation of medication in south Yunnan[J]. Chin J Parasitol Parasit Dis, 1994, 12(1): 31-33.(in Chinese)

杨恒林, 刘德全. 云南省恶性疟原虫对氯喹抗性的纵向监测[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 1994, 12(1): 31-33.

[11]Wang AP, Gao Q, Gu YP, et al. Studies onPlasmodiumfalciparumresistance to chloroquine by detection of pfcrt gene point mutation [J]. Chin J Schist Ctrl, 2005, 17(2): 120-123. (in Chinese)

王安平, 高琪, 顾亚萍, 等. 用 pfcrt 点突变基因检测技术检测恶性疟原虫氯喹抗药性的初步研究[J].中国血吸虫病防治杂志, 2005, 17(2): 120-123.