DNA甲基化在肿瘤发生中的作用

陈莉

·综述与讲座·

DNA甲基化在肿瘤发生中的作用

陈莉

DNA甲基化转移酶；组蛋白去乙酰化酶；甲基化结合蛋白;肿瘤

在肿瘤形成过程中，表观遗传学机制越来越受到重视。即DNA突变时核苷酸序列不变，通过碱基修饰的改变导致基因表达水平的变化。其中，一个重要机制就是DNA甲基化。DNA甲基化就是在DNA复制后，DNA在甲基转移酶催化下将S-腺苷甲硫氨酸(SAM)上的甲基连接到DNA分子的腺嘌呤碱基或胞嘧啶碱基上，进行DNA修复的过程。负责DNA甲基化作用的酶称为DNA甲基化转移酶(DNA Methyltransferases，DNMTs)。DNA甲基化主要发生在CpG二核苷酸中的胞嘧啶[1]，它对于维持染色体结构的稳定性，保障基因组表观遗传信息在亲代细胞间的正确传递起着重要作用。除此之外，DNMTs还直接参与基因的转录抑制和DNA复制的正确起始等。人类DNA甲基化系统的功能异常将会导致胚胎发育异常，亦可诱发恶性疾病甚至肿瘤的发生。近年来，国内外开展了许多有关DNA甲基化的分子生物学及其作用机制的研究，本文就相关研究现状予以综述。

1 DNMTs家族介绍

目前在哺乳动物中发现了3类DNMTs、Dnmt1、Dnmt2和Dnmt3，其中Dnmt3包括Dnmt3a、Dnmt3b和Dnmt3L，Dnmt3L缺乏有效的催化结构而无催化活性，但能够增强Dnmt3a、Dnmt3b的甲基化活性[2]。Dnmt2的结构和功能尚不十分明确[3]，目前研究认为它的DNA甲基化酶活性可能非常弱,而且识别位点并非CpG位点,在体外酶活性实验中,常常难以观测到DNA甲基化酶活性。Dnmt1和Dnmt3a、Dnmt3b在DNA甲基化修饰过程中起主要作用。人类DNA甲基化的完成主要通过Dnmt1和Dnmt3a、3b的作用。Dnmt1定位与染色体19p13.2，主要功能是在每次DNA复制后，对新合成的DNA链进行甲基化修饰，并维持甲基化状态的稳定，也是非CpG位点从头甲基化所必需的甲基化转移酶[4]。DNMT3a定位于人染色体2p33，DNMT3b定位于人染色体20q11.2，两者的功能主要是催化DNA甲基化新生位点，并在胚胎中建立起新的甲基化模式，即催化非甲基化的DNA成为甲基化的DNA，主要参与DNA的从头甲基化[5]。

2 HDACs家族介绍

目前在哺乳动物中已发现18个组蛋白去乙酰化酶( histone deacetylase，HDAC)，依据与酵母蛋白的同源性这些酶被分为三类。第Ⅰ类通常存在于细胞核内，包括HDAC1、HDAC2、HDAC3和HDAC8；第Ⅱ类通常能在细胞核与细胞质间穿梭，包括HDAC4、5、6、7、9和10；第Ⅲ类与前两类的结构完全不同，与酵母Sir2家族蛋白具有同源性，参与调节细胞的衰老和能量代谢，且不能被HDACs抑制剂曲古菌素A(trichostatin A,TSA)抑制。

3 DNMTs与HDACs的相互联系

有研究发现了5种甲基化结合蛋白(methyl-CpG binding proteins),MBD1、MBD2、MBD3、MBD4和MeCP2。MBD1、MBD2、MBD4能够与mCpG结合，MBD3没有特异性结合甲基化DNA的能力[6]。其中，MeCP2是唯一能识别单个甲基化CpG位点的结合蛋白，MeCP2能够通过转录抑制区(TRD)与半甲基化,全甲基化DNA形成复合物。Kitamoto等[7]研究认为，启动子区DNA甲基化与组蛋白的乙酰化修饰具有协同抑制基因转录的作用。Nan等[8]研究证明甲基化CpG结合蛋白与组蛋白去乙酰化酶共存于一个细胞复合物中，因而认为DNA甲基化与组蛋白去乙酰化在调控基因转录中密切相关。Fuks等[9]通过实验证明了DNMT1能直接与HDAC结合，并确定了特异性结合位点，这一发现更直接地证明DNA甲基化与组蛋白去乙酰化之间的协调作用。但是组蛋白去乙酰化抑制基因转录的作用依赖于甲基化CpG位点的数目。高密度的DNA甲基化使染色质结构高度紧缩并且非常稳定，从而抑制基因转录。

4 DNA甲基化的机制

DNA甲基化是一种表观遗传修饰，它不改变DNA的一级结构而调控组织特异性基因的表达。哺乳动物的DNA甲基化主要发生在CpG二核苷酸的胞嘧啶上，由DNA甲基化转移酶(DNA methyltransferases，DNMTs)催化完成，将S-腺苷甲硫氨酸(SAM)提供的的甲基基团转移至胞嘧啶的第5位碳原子上,使胞嘧啶甲基化为5-甲基胞嘧啶，最终完成DNA甲基化修饰过程。而DNA甲基转移酶是参与DNA甲基化过程的关键酶。基因组DNA中CpG二核苷酸结构高度聚集在一起，称为CpG岛。CpG岛为二联核苷(GC)含量>50%，长度>200 bp的DNA序列，主要位于管家基因和一些组织特异性基因的5’端，覆盖基因转录的启动子区和第一外显子，有时延伸到第一内含子，约60%的人类基因组启动子区含有CpG岛[10]。通过DNA甲基敏感限制性内切酶分析,发现人类基因组的甲基化与非甲基化区域间隔排列，非甲基化区主要存在于启动子区CpG岛、基因的5’端和第一个外显子区[11]。目前的研究发现，DNA甲基化的主要靶点是在基因编码区，但基因转录区甲基化并不关闭基因的表达，而启动子区CpG岛甲基化引起稳定的基因沉默,而转录区域的甲基化有助于消除转录噪音[12]。

CpG二核苷酸中的胞嘧啶甲基化是人类基因组中最主要的表观遗传改变。抑癌基因启动子区域CpG岛的甲基化通过一个涉及组蛋白去乙酰化和染色质紧缩的复杂过程而导致转录抑制。Dnmts与组蛋白修饰相关因子的相互作用是Dnmt调控基因表达的重要手段。Dnmt1的N末端可以与HDAC1、HDAC2结合,Dnmt3a和Dnmt3b也可以招募HDAC,从而使组蛋白去乙酰化[13]。Worthley等[14]研究表明，DNA甲基化能引起染色质结构、DNA、DNA稳定及DNA与蛋白质作用方式的改变，抑制基因转录从影响基因表达。

一般认为启动子区DNA甲基化通过两种途径抑制基因表达：第一种是甲基化CpG岛的甲基基团可以阻止特异性转录因子与启动子CpG位点的结合,直接抑制基因转录[15];另一种是通过DNA甲基结合蛋白(methyl-CpG-binding proteins,MBD)招募一些阻碍复合物,可以和启动子区甲基化DNA特异性结合，竞争性抑制了转录因子与特定的DNA序列的结合,间接抑制基因转录[16]。组织特异性基因启动子区CpG岛在特定的组织中保持非甲基化或低甲基化状态，而使该类基因表达增加，进而参与细胞的生长发育，使细胞向特定的组织方向分化；而在其他组织中的该类基因则呈高甲基化状态，表达受抑制。即转录活性基因呈去甲基化或低甲基化状态，而非活性基因呈高甲基化状态。许多非活性基因不能表达主要是由于启动子区域的CpG岛高度甲基化而不能启动转录，导致基因沉默[17]。通常情况下，启动子区的CpG岛处于非甲基化状态，基因能正常表达；当其发生甲基化时，便影响基因的转录调控，使基因表达沉默。因此，DNA甲基化与基因转录活性密切相关，一些抑癌基因由于启动子的甲基化使该基因表达沉默或下调，因此在调控组织细胞的生长分化和肿瘤的发生发展中起着重要作用[18]。另一方面，癌基因在肿瘤细胞中表达上调，与启动子区低甲基化密切相关。越来越多的研究表明[19]，无论异常的DNA高甲基化还是低甲基化均可导致基因表达异常，从而促进肿瘤的发生。

5 肿瘤中DNMTs过度表达

大多数肿瘤细胞的DNMTs表达水平明显高于正常细胞，并与抑癌基因启动子高甲基化状态相关，Jin等[20]研究发现，DNMT3b在大多数肿瘤细胞中过表达。曾宇等[21]采用RT-PCR技术检测DNMT1，3a、3bmRNA在40例膀胱癌组织及正常膀胱组织中的表达结果显示：膀胱癌组织中DNMT1、3b表达的阳性率均高于正常对照组，DNMT3a的表达率与正常对照组无明显差异，三种基因的表达在不同肿瘤分级、分期、生长方式及原发肿瘤与复发肿瘤之间差异无统计学意义。DNMT1与DNMT3b表达值明显相关，提示DNMT1、3b是膀胱癌形成、发展中的早期事件，可作为早期诊断和复发监测的有效指标，DNMT1和DNMT3b的表达可能存在共同调节机制。彭建新等[22]研究发现，肝癌组织中DNMT1，3a、3bmRNA显著高于其在癌旁组织，肝硬化组织和慢性肝炎组织中的表达，DNMT1蛋白表达与肿瘤大小，数目，有无血管侵犯，TNM分期有关。

6 DNA甲基化与肿瘤的治疗

Wnt通路在肿瘤发生发展过程中起着重要作用。SFRPs家族作为Wnt通路的重要拮抗剂，在结直肠癌细胞株及原发性结肠肿瘤样本中均发现4个SFRP家族成员(SFRP1、2、4、5)存在高频甲基化[23]，在胃癌，食管癌，肝癌，胰腺癌等其他消化道肿瘤中SFRPs基因也存在着不同程度的甲基化，且经甲基化转移酶抑制剂5-氮杂胞苷处理后可恢复SFRPs的表达。Uhm等[24]检测到在胆管癌细胞株中ID4、DLC-1、和SFRP1三种抑癌基因存在高度甲基化,而在非肿瘤组织及正常肝细胞株中检出率低,用5-氮杂胞苷处理后这些基因表达上调,这些结果不仅显示DNA甲基化异常可能促进胆管癌的发生,而且也说明DNA甲基化抑制剂可以用于肿瘤的治疗。Fan等[25]研究结果显示联合应用组蛋白去乙酰化酶抑制剂和DNMTs抑制剂可以恢复ER alpha阴性乳腺癌细胞株对内分泌治疗的敏感性。这些实验研究证实了DNA甲基化抑制剂可以诱导肿瘤抑制基因的表达,它们将作为抗癌制剂在肿瘤治疗中发挥重要作用。

由于高度甲基化而导致的抑癌基因转录失活并不改变基因本身的序列，因此从理论上说，恢复基因的正常甲基化状态可以重新激活基因的功能，这为抗肿瘤药物的设计提供了一个新的思路。DNMTs是DNA甲基化过程的关键酶。DNMTs抑制剂是通过抑制DNMTs活性、逆转基因异常甲基化状态，而达到抗癌效果的药物。因此，DNMTs将有可能作为肿瘤治疗的新靶点。目前已用于临床试验的主要是胞苷结构类似物(5氮杂胞苷、5氮杂脱氧胞苷)，研究表明这类药物具有恢复沉默基因活性、促进细胞分化等效果，但5氮杂脱氧胞苷具有较强的细胞毒性等不良反应。DNMTs抑制剂类药物及作用机理有待我们更深入研究。

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056001 河北省邯郸市中心医院血液肿瘤科

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