VEGF、MVD、Ki-67联合检测与大肠癌临床病理特征及预后相关性的研究

赵春清 刘志 闫威 张涛 张彬 李威 刘松 娄红

·论著·

VEGF、MVD、Ki-67联合检测与大肠癌临床病理特征及预后相关性的研究

赵春清 刘志 闫威 张涛 张彬 李威 刘松 娄红

目的探讨血管内皮生长因子(vascular endo-thelial growth factor， VEGF)、微血管密度(microvessel density， MVD)和细胞增殖核抗原(Ki-67)在大肠癌组织中的表达及预后意义。方法采用免疫组织化学检测64例大肠癌组织中VEGF、MVD和Ki-67的表达情况，并分析其与大肠癌临床病理特点和预后的关系。结果免疫组织化学检测显示VEGF、MVD、Ki-67表达在不同Dukes分期、淋巴结有无转移中存在明显差异(P<0.05)，不同分化程度之间MVD表达存在差异(P<0.05)，而三者的表达与性别、年龄、部位、大小无关(P>0.05)，VEGF、Ki-67表达与MVD呈正相关，且VEGF、MVD表达与预后相关。结论VEGF、MVD、Ki-67表达与Dukes分期、淋巴结转移、肿瘤分化程度相关，VEGF、MVD与预后相关，可作为检测大肠癌预后的参考指标。

大肠癌;VEGF;MVD;Ki67;免疫组织化学

大肠癌(colorectal cancer，CRC)为结肠癌和直肠癌的总称，是胃肠道最常见的恶性肿瘤之一，仅次于胃癌、食管癌，是世界第三大恶性肿瘤，在西方国家中居恶性肿瘤死因的第2位[1]。由于生活方式、生存环境及饮食结构的改变，我国大肠癌的发病率呈逐年增高的趋势[2]，而大肠癌的发生、发展及预后因素尚不清楚，血管内皮生长因子 VEGF 被认为是最重要的血管形成因子[3]，血管的生成在肿瘤的生长和转移中起着至关重要的作用，微血管密度(MVD)是反映肿瘤组织内血管生成状况的一个重要参数，Ki-67 是一种反映细胞分裂和增殖活性的标志物，Ki-67 在肿瘤组织中表达高低，与肿瘤的增殖密切相关[4]，本研究通过免疫组织化学检测VEGF、MVD和Ki-67的表达，分析与临床病理特点及预后的关系，报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取 2005年1月1日至2007年12月31日我院收治并经病理证实的大肠癌患者64例，癌旁正常组织20例(距癌灶>5 cm)，所有患者术前均未行任何抗肿瘤治疗，术后标本均经病理证实，术后随访5年(随访资料完整)，男35例，女29例；年龄30～82岁，中位年龄55岁。肿瘤部位：直肠24例，结肠40例(乙状结肠20例、升结肠8例、降结肠10例、横结肠2例)；淋巴结转移阳性 25例，阴性39例；高中分化49例，低分化15例；肿瘤直径≥5 cm 34例，<5 cm 30例；Dukes分期：A+B期26例，C+D期38例。

1.2 试剂 一抗兔抗人 VEGF 单克隆抗体，一抗鼠抗人 Ki67 单克隆抗体，鼠抗人 CD34单克隆抗体，即用型S-P免疫组化染色试剂盒均为 Santa cruz公司产品 (北京中杉金桥生物技术有限公司)，用已知阳性标本作为阳性对照,以 PBS代替一抗为阴性对照。

1.3 方法 所有标本均经 10%中性福尔马林溶液固定，石蜡包埋，连续制成 4 μm 厚切片若干张，进行SP 法免疫组化染色，实验步骤按试剂盒说明书进行。

1.4 免疫结果的判定 VEGF计数：VEGF蛋白主要定位于癌细胞的细胞浆中,呈棕黄色/棕褐色,参照 Saito 等[5]综合计分法由阳性着色细胞所占百分数与细胞着色强度二者结合起来判断。阳性着色细胞<5%计0分;5%～25%计1分;26%～50%计2分;51%～75%计3分;>75%计4分。细胞着色强度:不着色计0分;淡黄色计1分;棕黄色计2分;棕褐色计3分。二者积分相加0～2分为阴性,>3分为阳性。MVD计数方法：CD34单克隆抗体能与血管内皮细胞上的CD34蛋白相结合,定位于血管内皮,呈棕褐色。参照Weidner等[6]评判标准计算,先在低倍视野内(40、100×)找到肿瘤组织内微血管密度最高的区域(hot spot),然后在高倍视野内(200×)通过计算机图像分析系统在监视器上计数微血管的数目,凡呈现棕色单个内皮细胞或内皮细胞簇者均作为 1 个血管计数单位,管腔面积大于8个红细胞直径的血管不计数，每张切片在200倍视野下计数5个视野,取平均值。Ki67主要表达于细胞核，每张切片观察5个高倍镜视野，每个视野计数100个肿瘤细胞，阳性细胞所占比例≥10%为阳性(+)，<10%为阴性[7]。

2 结果

2.1 VEGF、Ki-67表达及MVD计数 VEGF表达主要定位于胞浆，呈黄色或棕黄色颗粒状分布。VEGF在大肠癌组织的阳性表达率87.50%(56/64)，在癌旁正常组织阳性表达率5%(1/20)，两者之间存在显著差异(P<0.05)，Ki-67的表达主要定位于细胞核，呈棕黄色颗粒。Ki-67在大肠癌组织的阳性表达率89.06%(57/64)，在癌旁正常组织的表达率10%(2/20)，存在显著差异(P<0.05)，大肠癌组织中的MVD计数(25.13±5.43)明显高于癌旁组织(13.31±4.21)，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1、2。

图1 VEGF在大肠癌组织中的表达(SP×200)

图2 Ki⁃67在大肠癌组织中的表达(SP×400)

2.2 VEGF、MVD、Ki-67与临床病理特点的相关性 VEGF、Ki-67表达及MVD计数与临床病理特征的相关性，免疫组织化学检测显示，VEGF、Ki-67、MVD表达与Dukes分期、淋巴结转移相关，且随着Dukes分期的增高表达增强(C+D期明显高于A+B期)，淋巴结转移组明显高于无转移组，两者之间差异有统计学意义(P<0.05),MVD计数在低分化组明显高于高中分化组，两者之间差异有统计学意义(P<0.05),三者的表达在性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小之间差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.3 VEGF、Ki-67阳性组，阴性组表达与MVD比较 VEGF、Ki-67、MVD三者之间的相关性，本研究64例大肠癌组织中的MVD计数均值为(25.13±5.43)，VEGF阳性组MVD计数显著高于阴性组，差异有统计学意义(P<0.05),ki-67阳性组MVD计数明显高于阴性组，差异有统计学意义(P<0.05),VEGF、Ki-67表达经Spearman等级相关分析结果显示，VEGF、Ki-67的表达与MVD呈正相关。见表2、3。

表1 VEGF、MVD、Ki-67与临床病理特点的相关性

2.4 VEGF、Ki-67、MVD表达与大肠癌的预后 本组研究中64例大肠癌患者3年生存率84.38%(54/64),5年生存率64.06(41/64)，VEGF表达阳性组(生存率62.5%)与阴性组(生存率75%)5年生存率经Log- Rank 法检验差异有统计学意义(P=0.000)，而Ki-67阳性组(生存率64.91%)与阴性组(生存率57.14%)5年生存率差异无统计学意义(P=0.190)。大于MVD均值组(生存率50%)与小于均值(生存率78.13%)比较，5年生存率差异也有统计学意义(P=0.000)。见图3～5。

表2 VEGF、Ki-67阳性组、阴性组表达与MVD比较

表3 VEGF、Ki-67与MVD的相关性 例

图3 生存时间(月)

图4 生存时间(月)

图5 生存时间(月)

3 讨论

肿瘤的发生、发展、转移、预后是一个多因素，多步骤的复杂过程，而在这一过程中肿瘤血管的形成及细胞增殖起着至关重要的作用。目前对于VEGF在肿瘤中的作用及表达主要停留在体外实验阶段，部分研究发现在肾癌，乳腺癌，黑素瘤，肝癌，胃癌，膀胱癌，子宫内膜癌，大肠癌及胚胎组织性肿瘤中多有表达，并明显高于非肿瘤组织[8]，Ki-67是一种存在于增殖细胞核的与细胞增殖密切相关的核蛋白，是目前公认的检测细胞增殖活性较为准确、可靠、理想的抗原[9]，而增殖活性高的肿瘤具有更高的侵袭性，本研究发现VEGF、Ki67、MVD的表达明显高于癌旁正常组织，差异有统计学意义(P<0.05)，与文献报道相符，提示三者的表达与肿瘤的发生相关。

目前研究认为肿瘤的血管生成在其生长 浸润和转移中起着重要作用 并影响肿瘤的生物学行为和预后，肿瘤血管生成的定量评估包括 MVD 和VEGF[10]。有学者研究发现VEGF可以通过促进大肠癌中血管的生成而促进癌的不断生长、浸润甚至转移，其表达程度的高低与大肠癌的生物学行为密切相关，它的过表达可能是结肠癌预后的不良因子，而血管的大量滋生，必然促进细胞过度增殖，同时细胞的增殖也需要大量新生血管提供必要营养支持，二者之间关系密切。另有学者研究发现实体肿瘤直径超过1～2 mm，如果没有新生血管的形成，肿瘤将停止生长[11]，本研究发现VEGF、Ki67、MVD的表达在Dukes分期C、D期组和淋巴结有转移组明显高于A、B期组及淋巴结无转移组，表达存在明显差异(P<0.05)，MVD在大肠癌低分化组表达明显高于高中分化组，差异有统计学意义(P<0.05),且VEGF、Ki67的表达与MVD呈正相关性，由此我们认为大肠癌的恶化及转移与三者高表达相关，推测三者可能具有正协同作用，在临床上，VEGF、Ki-67、MVD异常高表达可作为判断大肠癌侵袭性的一个重要分子生物学指标，同时检测到手术标本中VEGF、Ki-67、MVD高表达情况，可对大肠癌恶性程度的早期评估提供依据。

本研究经随访发现，VEGF阳性组及MVD高表达组(大于均值组)5年生存率与VEGF阴性组及MVD低表达组存在显著差异(P<0.05)，提示VEGF与MVD与大肠癌的预后相关，而Ki-67阳性组与阴性组之间5年生存率接近，两者之间无差异性(P>0.05)，表明Ki-67表达对大肠癌患者预后影响不大。

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StudyonthecorrelationbetweencombineddetectionofVEGF,MVD,Ki-67andclinicalpathologicalcharacteristicsofcolorectalcarcinomaaswellaspatient’sprognosis

ZHAOChunqing,LIUZhi,YANWei,etal.

DepartmentofGeneralSurgery,TheSecondHospitalofBaodingCity,Hebei,Baoding071000,China

ObjectiveTo investigate the expression and the prognostic significance of vascular endothelial growth factor (VEGF),microvessel density (MVD) and Ki-67 in colorectal carcinoma.MethodsThe expression levels of VEGF,MVD and Ki-67 were detected by immunohistochemistry in 64 cases of colorectal carcinoma,and the correlation between their expressions and clinical pathological characteristics and prognosis of colorectal carcinoma was analyzed.ResultsThe results by immunohistochemical staining showed that there were significant differences in the expression levels of VEGF MVD and Ki-67 in different Dukes stages,with or without lymph node metastasis (P<0.05),there were significant differences in the expression levels of MVD in different differentiation degree (P<0.05).However the expressions of VEGF,MVD and Ki-67 were not related with patient’s age and sex,tumor’s size and position (P>0.05),moreover,the expression levels of VEGF and Ki-67 were positively correlated to those of MVD,and the expression of VEGF and MVD was correlated to patient’s prognosis.ConclusionThe expressions of VEGF,MVD,Ki-67 are related with Dukes staging,lymph node metastasis,tumor differentiation degree.The expression of VEGF and MVD is correlated to prognosis of patients with colorectal carcinoma,which can be regarded as reference parameters for evaluating patient’s prognosis.

colorectal carcinoma;VEGF;MVD;Ki67;immunohistochemistry

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.21.008

071000 河北省保定市第二医院普外科

刘志，071000 河北省保定市第二医院普外科；

E-mail：lz192@foxmail.com

R 735.34

A

1002-7386(2014)21-3226-04

2014-04-12)