临床分离鲍曼不动杆菌耐消毒剂基因携带情况分析及消毒对策

于文静 闻海丰 秦瑾 冯忠军

消毒剂常被医疗机构应用于各种医疗设施和环境表面的消毒［1］，在预防和控制病原菌在医院内的传播方面起到了重要的作用，但消毒剂的长期广泛使用有可能使细菌产生对消毒剂环境的适应，导致对消毒剂产生抗性。近年来国内外学者已从多重耐药鲍曼不动杆菌中检出携带耐消毒剂基因qacEΔ1-sul1的菌株，且携带率较高［2-5］。鲍曼不动杆菌具有极强的环境适应能力和获得外源性耐药基因的能力［6］。因此做好鲍曼不动杆菌耐消毒剂基因qacEΔ1-sul1的监测，了解其对常用消毒剂的抗性，将有助于合理选择与使用消毒剂，对控制其传播有重要的意义。本文对临床分离的73株多重耐药鲍曼不动杆菌qacEΔ1-sul1基因的携带情况及其含氯消毒剂的耐受状态进行研究。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 试验菌株分离自河北医科大学第三医院2012年10月至2013年6月住院患者及其住院环境的送检标本(排除同一患者重复分离菌株)，其中男50例，女19例;年龄1～89岁。标本来源主要为:痰液37株、血液5株、伤口分泌物22株、ICU环境表面分离4株，尿液、导管、腹水、脑脊液、咽试子各1株。标本来自科室主要是ICU 29株，创伤急救中心11株，急诊科7株，其余菌株分布在不同的科室。全部菌株均符合多重耐药菌的标准，经ID32E鉴定试剂卡鉴定后，采用滤纸保存法，冻存于-80℃备用。

1.2 主要仪器与试剂ABI7300型荧光定量PCR检测仪为美国生物应用公司产品，肠杆菌科和其他非苛氧革兰阴性鉴定试剂为由法国生物梅里埃公司产品，DNA Marker 1由广东东盛生物技术有限公司提供，绿色体系［Green PCR Master Mix(2x)］由Fermentas提供，核酸染料GoldViewⅠ由北京索莱宝科技有限公司提供;含氯消毒剂为泡腾消毒片Ⅱ型，主要成分为三氯异氰尿酸，由山东利尔康消毒科技股份有限公司提供。

1.3 方法

1.3.1 菌悬液制备:在含有菌株的EP管中加入2 ml营养肉汤，孵育过夜，后接种到哥伦比亚血琼脂培养基上，孵育过夜后取典型的菌落，悬浮于2 ml 0.9%氯化钠溶液中，配制成0.5麦氏浊度的菌悬液备用。

1.3.2 药敏试验:采用纸片扩散法测定13种抗菌药物的敏感性，包括哌拉西林、头孢他啶、亚胺培南、头孢哌酮、头孢曲松、庆大霉素、环丙沙星、阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦、头孢吡肟、头孢哌酮/舒巴坦、左氧氟沙星、甲氧苄啶/磺胺甲噁唑。由温州市康泰生物科技有限公司提供，质控菌株为大肠杆菌ATCC25922，根据美国实验室标准化研究所(CLSI)2010年版进行抗菌药物敏感性判断。

1.3.3 耐消毒剂基因qacEΔ1-sul1检测qacEΔl-sul1基因引物序列［6］如下:P1:5’-TAGCGAGGG CTTT ACTAAGC-3’，P2:5’-ATTCAGAATGCCGAACACCG-3’，PCR扩增后阳性产物长度为300bp。引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成。细菌基因组DNA提取试剂盒由北京康为世纪生物技术有限公司提供;PCR扩增反应体系如下:P1引物2 μl(10 μmol/L)、P2引物2 μl(10 μmol/L)，PCR反应液Green PCR Master Mix(2x)25 μl、模板3 μl、超纯水18 μl，总反应体积50 μl。PCR热循环参数为:95℃预变性2 min，然后95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸40 s，共进行35个循环，最后72℃延伸5 min。取5 μl扩增产物在2%琼脂糖凝胶中电泳35 min，电压100 V，出现与阳性对照分子相当的目的条带判为阳性，并拍照保存。

1.3.4 消毒剂敏感性检测:对73株鲍曼不动杆菌进行最小抑菌浓度(MIC)按《消毒技术规范》(2002年版)规定的最小抑菌浓度测定实验(营养肉汤稀释法)进行检测。取一片消毒片有效氯浓度为500 mg/L放入到500 ml蒸馏水中，配成浓度为1 000 mg/L的消毒液，然后将消毒液稀释成500 mg/L、400 mg/L、300 mg/L、250 mg/L。分别将2.5 ml不同浓度的消毒液加到无菌试管中，再向各管中加2.5 ml的双倍营养肉汤。最后在管中加入70 μl(1.5×108cfu/ml)菌悬液混匀，使其含菌量为5×105cfu/ml～5×106cfu/ml。将试验菌、阳性对照及阴性对照试管放置37℃培养箱中，培养48 h，观察结果。无细菌生长的最高稀释度所对应的抗(抑)菌剂浓度为消毒剂判为受试菌的MIC。

2 结果

2.1 药敏试验结果73株鲍曼不动杆菌对13种抗菌药物的药敏结果 见表1。

表1 73株鲍曼不动杆菌对13种抗菌药物的药敏试验结果株(%)

2.2 耐消毒剂基因qacEΔ1-sul1检测结果73株鲍曼不动杆菌中37株qacEΔ1-sul1基因阳性，阳性率为50.68%。见图1。

图1 耐消毒剂基因qacEΔ1-sul1检测结果

2.3 MIC检测结果 含氯消毒剂对鲍曼不动杆菌的平均MIC值为365.07 mg/L。见表2。

表2 鲍曼不动杆菌对含氯消毒剂MIC测定结果

3 讨论

近年来鲍曼不动杆菌的耐药性日益增强，可以通过固有的耐药基因或获取外源基因元件如质粒、整合子、转座子或耐药基因岛使其成为多重耐药或泛耐药的菌株［7］，给临床治疗带来极大的困难。本研究结果显示临床分离的菌株除对头孢哌酮/舒巴坦的敏感性为21.91%以外，对其他抗菌药物的耐药率高达86.30%～97.26%，可见临床分离的鲍曼不动杆菌耐药情况严重。在分离的73株鲍曼不动杆菌中，有29株分离自ICU病房，11株分离自骨科创伤急救病房，在这些病房中病人的免疫力低下，且接受侵入性操作，更增加了鲍曼不动杆菌感染的机会。对于多重耐药菌的感染患者，临床除了使用抗菌药物治疗之外，各种消毒剂的使用也是非常有效的控制措施。

研究表明，随着消毒剂大量广泛的应用，由于往往存在有机物(血、组织、体液、脂质等)干扰，常导致细菌反复接触亚致死量消毒剂，部分病原菌出现对某些消毒剂的敏感性降低甚至耐药的情况，这与耐抗生素菌株一样，抗消毒剂菌株的出现可能将会导致医院消毒的失败［8-10］。其原因有细菌细胞外层结构特点或化学组成(外膜蛋白和脂多糖等)引起的对某些消毒剂的天然抗性;有的细菌则可因细胞基因的改变(质粒通过携带专门的抗性基因而介导)可产生获得性抗力;也可能由于消毒剂选择压力导致突变株的出现。细菌耐消毒剂主要为获得qac基因所致。qac基因表达多种消毒剂化合物外排泵蛋白，获得qac基因可表现为对胺类、胍类、腙类消毒剂耐药。目前已发现的qac基因家族有qacA、qacB、qacC、qacD、qacE、qacE△1、qacF、qacG、qacH、qacJ等10种［10］。

鲍曼不动杆菌作为临床主要病原菌之一，其对消毒剂敏感性降低的报道不一［1，11，12］，但耐消毒剂基因qacEΔ1-sul1的携带率较高，本研究中几乎一半菌株携带此基因，与文献中报道［5，6］的基本一致。细菌对消毒剂产生抗性有可能会对细菌的抗生素耐药产生影响。含氯消毒剂为一种高效消毒剂，可杀灭包括细菌芽孢在内的所有微生物。医院中一般污染物品和环境物体表面消毒都采用有效氯为250～500 mg/L，本研究采500、400、300、250 mg/L不同浓度梯度的消毒剂对鲍曼不动杆菌进行消毒剂耐药性监测，结果表明杀菌效果良好。消毒剂的大量使用会导致细菌对消毒剂的敏感性降低，但是消毒剂耐药细菌在自然界的水平很低，并且对消毒剂耐药的浓度也远低于在医院、家庭和工业等环境中的正常使用浓度。临床不规范使用消毒剂和未妥善保存消毒剂可能使消毒剂有效成分降低，因此在临床实际工作中应根据菌株种类选择合适的消毒剂，以免受先天抗性的影响。而且在应用消毒剂时，以大剂量一次将菌全部杀死为宜。另外，选择压力在细菌对消毒剂抗性中的作用也不容忽视。

虽然抗生素和消毒剂对细菌的作用靶位、杀菌效果、性能和临床应用方面有所不同，但也存在很多相似之处:通过被动扩散作用穿过细菌包膜，影响膜的形态和完整性，影响细菌的代谢过程(核酸的复制、转录、翻译，物质的转运和各种酶的活性)。细菌对抗生素和消毒剂也表现出相似的防御机制，例如通过渗透性改变、外排作用、形成生物膜和对抗生素和消毒剂进行转化，通过基因突变或获得可移动的基因元件(如转座子、质粒)编码耐药物质(酶、转运蛋白)。抗生素耐药和消毒剂耐药存在共同的调节通路。多数主动外排泵为广谱，能外排包括抗菌药物和消毒剂在内的多种有害物质。不少抗菌药物耐药基因由质粒携带，而质粒上可携带如qac等外排基因。抗菌药物和消毒剂可能有共同作用的位点，靶位改变将带来对抗菌药物和消毒剂的敏感性降低。对抗菌药物耐药不一定会导致对消毒剂敏感性降低，多重耐药菌是否会对消毒剂敏感性降低取决于菌种和耐药机制。值得注意的是，共同的耐药机制可能导致对抗菌药物和消毒剂交叉耐药。使用亚致死量的消毒剂可导致对抗菌药物的MIC上升，实验条件下，某种消毒剂(如三氯生)可诱导出对抗菌药物敏感性降低的菌株。但在临床中，关于消毒剂使用可诱导或筛查出抗菌药物耐药菌株的报道尚未见到。况且，实验室条件下诱导的对消毒剂敏感性降低的菌株能够被工作浓度的消毒剂杀灭，因而这些敏感性降低的菌株临床意义很小。本研究显示，耐药菌对消毒剂的抵抗力变化不明显，即使出现抵抗力，也只是最低抑菌浓度(MIC)提高2～3倍。

正如抗菌药物滥用导致高耐药率一样，细菌耐消毒剂现象也逐渐突显出来。因此，要重视消毒剂在临床上的规范使用，医疗机构应该建立专门的消毒管理组织，加强科学使用消毒剂的管理和培训。根据医院实际情况，将医疗机构环境清洁卫生等级进行分类，并根据环境感染危险度类别和清洁卫生等级管理要求制定标准化操作规程，内容应包括清洁与消毒的工作流程、时间和频率。应明确使用的清洁剂与消毒剂名称、配制浓度、作用时间，以及使用中清洁剂与消毒剂更换的空间和时间规定等;明确医务人员与环境清洁卫生服务人员的职责分工，指导临床正确进行消毒，强调预防先于控制，提高手卫生依从性。积极开展临床菌株对消毒剂敏感性监测及其相关研究，密切关注其变化趋势，及时发现临床菌株对消毒剂抗性的变化，以便有针对性地调整消毒剂在临床实际工作中的有效使用浓度，甚至及时更换消毒剂种类，共同应对临床菌株对消毒剂耐药性的挑战。

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5 赵丽霞，王家平，王苏建，等.医院感染患者临床分离细菌耐消毒剂基因的检测分析.中华医院感染学杂志，2009，19:124-125.

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9 Nagai K，Murata T，Ohta S，et al.Two different mechanisms are involved in the extremely high-level benzalkonium chloride resistance of a Pseudomonas fluorescens strain.Microbiol Immunol，2003，47:709-715.

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