低密度脂蛋白受体相关蛋白5对骨的影响

吴学伦，朱晓燕(综述)，薛 鹏，李玉坤*(审校)

(1.河北医科大学第三医院内分泌二科，河北省骨科生物力学重点实验室，河北 石家庄 050051；2.河北省邢台市人民医院肿瘤内科，河北 邢台 054000)

低密度脂蛋白受体相关蛋白5(low density lipoprotein receptor related protein，LRP5)是低密度脂蛋白受体相关蛋白家族成员之一，表达于人类多种组织细胞，以肝脏、胰腺最多。在骨中主要表达于骨内膜和骨小梁表面的成骨细胞，尚未发现在破骨细胞表达。LRP5与果蝇生长因子Wingless共受体Arrow序列同源，它是由1 615个氨基酸组成的跨膜蛋白，由一个假定的信号肽、4个表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)样重复序列、3个低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor，LDLR)重复序列跨膜区和胞内区部分组成。人LRP5进化高度保守，与小鼠LRP5的蛋白序列95 %同源[1]。

1 LRP5概述

LRP5功能缺失突变会导致骨质疏松症假神经胶质瘤(osteoporosis pseudoglioma syndrome，OPPG)，OPPG是一种骨形成严重减少和胚胎期视血管持续形成进而导致低骨量和失明的罕见疾病[2]。另外，LRP5功能获得突变会导致一种高骨量综合征(high bone mass syndrome，HBM)，HBM具有非常高的骨量，耐高冲击性骨折(比如车祸)，并且游泳时不能浮在水面上[3]。同种基因的不同突变导致两种性质相反的骨骼疾病，表明LRP5通路对骨形成及骨量至关重要。

LRP5通过成骨细胞Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路调节骨量。LRP5(和同源LRP6)与卷曲蛋白(frizzled)一起作为Wnt蛋白的共受体。Wnt与LRP5-frizzled共受体结合使糖原合酶激酶-3β(glycogen synthase kinase，GSK-3β)失活，导致β-catenin的胞质积累，随后β-catenin转移至细胞核影响基因转录。实验[4]表明，LRP5为成骨细胞Wnt信号和β-catenin激活所必需，其基因突变阻碍了LRP5内化及与其他配体Dkk1等的结合。LRP5与Arrow序列同源，Wnt蛋白启动的LRP5和Axin交互细胞实验同样表明，LRP5是Wnt蛋白的一个共受体。因此，OPPG和HBM被视为Wnt相关疾病。

然而，某些实验研究的结果与这一观点相矛盾。第一，与大多数Wnt蛋白功能发展形成鲜明对比的是，LRP5功能缺失突变(LRP5-/-)胚胎并没有明显的骨骼缺损；第二，功能获得性LRP5基因突变不会引起骨肿瘤，Wnt信号通路在其他器官的活化则可能会导致骨肿瘤的发生[5]；第三，成骨细胞经典Wnt信号通路的分子节点β-catenin的特定缺失和功能获得突变，既不影响骨形成，也不影响LRP5特异性失活所引发的失控基因的表达[6]。这些研究结果表明，LRP5和经典Wnt信号通路通过不同机制调节成骨细胞的功能。

5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)是产生于脑干神经元和肠嗜铬细胞的一种活性胺，不能通过血脑屏障。因此，由于其合成的部位不同，它实际上具有2种功能特性，大脑产生的5-HT参与人的认知功能；而占总数95%的肠道5-HT，即肠源性血清素(gut derived serotonin，GDS)的功能，目前尚存争议。GDS生物合成途径与限速酶色氨酸羟化酶1(tryptophan hydroxylase 1，Tph1)有关。GDS释放、弥散于血液中，大多数通过特定运输途径被血小板摄取、储存，另外在血清中游离的一小部分，与靶细胞的5-HT受体(5-hydroxytryptamine receptor，HTR)结合发挥作用。值得注意的是，长期服用5-HT再摄取抑制剂(serotonin specific reuptake inhibitor，SSRIs)的患者，其细胞外5-HT的浓度增加，而骨量减少[7]。另外，在寻找解释LRP5调节骨形成的分子机制过程中，Yadav等[8]确定Tph1是LRP5-/-模型中骨组织过度表达程度最高的基因；Tph1在敲除LRP5的十二指肠细胞中表达也会增加。抑制LRP5-/-小鼠的5-HT合成能纠正其骨表型，肠道特定敲除LRP5 能复制LRP5-/-小鼠的骨表型，但在成骨细胞敲除则不能。5-HT结合到HTR1B受体，通过调节CyclinD1分子的表达，影响成骨细胞增殖，最终决定骨形成的程度。

2 LRP5突变导致的骨骼疾病

LRP5突变主要导致2种骨骼疾病的发生：一种是常染色体隐性遗传疾病——OPPG，以出生早期出现的视力损害及骨脆性增加为特点；另一种是常染色体显性遗传疾病——HBM，主要影响长骨和颅骨的皮质骨。这两种疾病的分子决定因素都映射到11号染色体相同的区域，后来被证实为LRP5编码区。

OPPG患者的LRP5基因突变，导致LRP5功能缺失和Wnt信号活动减少，进而导致成骨细胞活动减少，这与在小鼠模型中特定破坏LRP5的骨骼表型相一致[9]。HBM表型患者杂合LRP突变的分子特点表明，此突变发生于LRP5结构中一个进化高度保守的区域，形成一个β螺旋结构，通过此结构，LRP5与Dkk1相互作用。体外试验进一步证明，在LRP5错义突变情况下，Dkk1对Wnt信号的正常抑制发生缺陷，从而导致Wnt信号和成骨细胞活动增加，这一结论在LRP5突变小鼠的成骨细胞系细胞中得以证实[10]。后续7个不同的LRP5基因突变的分子特性呈现出一种明显的HBM，表明LRP5突变蛋白减少了与Dkk1的交互作用且受Dkk1的抑制程度降低。

与上述发现相一致，最近的研究也表明，在骨细胞中含有特定OPPG错义突变的LRP5表达的小鼠，会导致骨量丢失；在晚期成骨细胞和骨细胞中含有特定HBM错义突变的LRP5表达的小鼠，会导致骨量增加。另外，LRP5 似乎作用于其局部微环境，因为LRP5的HBM形式特定限制在外周骨，导致外周骨量的增加，对中枢骨量没有影响[11]。总之，同一基因LRP5的突变导致本质完全相反的骨疾病(低或高骨质)，均能表明LRP5在骨形成中的重要作用。

3 LRP5对骨的直接作用

2个不同研究机构已经观察到LRP5获得性突变对骨骼的直接影响。Yadav等[12]把G171V敲进cDNA的LRP5基因突变编码区域，其模型优势在于有一个环状5′-端的cDNA终止序列，以致G171V等位基因的表达能在特定组织通过cre介导重组被激活。Babij等[13]使用3.6kol鼠Ⅰ型胶原蛋白启动子在小鼠成骨细胞过表达人类LRP5-G171V功能突变。这种转基因小鼠成骨细胞呈现HBM表型。此外，成骨细胞的野生型受体的过度表达也会增加骨量，然而与G171V诱导成骨细胞的过表达程度不同。这些观察尽管与Yadav等[12]研究结果不同，但都表明LRP5有直接的骨骼效应。鉴于动物模型之间的差异，LRP5及其功能获得性突变可能只在过量时存在直接的骨骼效应，而不是在生理水平。另外，两者的差异可能源于不同系种、不同阶段成骨细胞启动子的利用。成骨细胞谱系LRP5信号通路有可能在的早期阶段是必需的，而Yadav等[8]在LRP5对早期骨骼施加直接影响后，才开始驱动成骨细胞LRP5突变。

LRP5-/-小鼠原代成骨细胞机械负荷反应改变表明，LRP5对骨骼存在直接作用[14]。机械负荷和其他刺激可能产生一个局部环境刺激LRP5直接骨骼效应。

研究表明LRP5是一个真正的Wnt受体。然而，是否经典Wnt信号途径足够解释LRP5突变对骨量的影响？尽管LRP5缺失的纯合子小鼠(具有与OPPG患者相似的特点)出生后骨量低源于成骨细胞数量和活动较少，而早期或晚期成骨或骨细胞β-catenin缺失小鼠的骨量减少，主要是由于骨吸收增加而不是骨形成减少。而且，骨Wnt针对性去除引起的骨吸收增加，至少部分是由于破骨细胞分化因子配体(nuclear factor-κB ligand，RANKL)的激活和骨分化抑制剂骨保护素(osteoprotegerin，OPG)表达的减少[6, 15]。有趣的是，应该注意成骨细胞/骨细胞β-catenin缺失小鼠骨吸收增加和骨量减少，与包含一个自发的低密度脂蛋白受体相关蛋白6(low density lipoprotein receptor related protein，LRP6)次等位基因突变小鼠骨表型非常类似。因此，LRP5和LRP6是否以同样的方式调节Wnt信号？LRP5在成骨细胞内作用是否增强成骨细胞活动和骨形成？LRP6在成骨细胞内作用是否限制破骨细胞的功能？上述问题仍有待进一步研究[16-17]。

4 LRP5对骨的间接作用

LRP5-/-小鼠骨细胞增殖相关基因表达下降。据报道，LRP5-/-小鼠成骨细胞缺乏，而从LRP5-/-小鼠分离的成骨细胞体外增殖正常，所以可能是成骨细胞外信号导致了LRP5-/-成骨细胞增殖的减少。Tph1是在LRP5-/-骨中表达差异最大的基因，而且LRP5-/-小鼠在十二指肠也有Tph1表达并随5-HT水平升高。高水平5-HT抑制LRP5-/-和野生型小鼠体外成骨细胞的增殖，而LRP5-/-小鼠低色氨酸饮食或给予5-HT的合成抑制剂后表现出5-HT浓度降低和骨骼表型的正常。这些结果初步证明高水平的5-HT抑制LRP5-/-小鼠骨形成，导致其骨量下降[18]。

为研究LRP5、5-HT与骨之间联系，从而培育出肠道或成骨细胞特定LRP5功能缺失或增强性转基因小鼠。肠道LRP5特定剔除，呈现出5-HT高循环水平与LRP5-/-小鼠骨骼表型，成骨细胞特定剔除则没有出现上述结果。相反，通过插入编码HBM突变的LRP5-G171V cDNA使肠道LRP5过表达，5-HT浓度降低并产生高骨表型，成骨细胞特定表达则没有出现上述结果。上述研究结果证实，LRP5通过影响肠道间接调节骨形成。确定5-HT作为肠道LRP5和骨骼的介质后，肠道特定删除Tph1降低5-HT循环水平并产生高骨质量表型，而成骨细胞Tph1特定删除则没有[4]。

升高的5-HT作为一种激素，作用于成骨细胞抑制骨形成。成骨细胞膜表面表达3种5-HT受体：HTR1B、HTR2A和HTR2B。小鼠全部HTR2A基因删除或成骨细胞特定HTR2B删除，并不显示骨骼表型；然而，小鼠成骨细胞特定删除或全身至少HTR1B基因的一个等位基因的剔除，显示与肠道HBM LRP5-G171V基因突变小鼠类似的HBM表型。这表明HT1B调节5-HT受体介导的成骨细胞效应。体外研究证实，来自HTR2A和HTR2B缺失突变小鼠的原代成骨细胞对5-HT的应答，与野生动物的成骨细胞类似，而HTR1B缺失突变小鼠成骨细胞对5-HT特定介质反应迟钝。随后研究显示，5-HT信号通路转录因子是成骨细胞cAMP反应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB)，能够双向调节基因转录。5-HT结合HTR1B，抑制CREB表达，进而抑制D型细胞周期蛋 白1(cyclin D1，CycD1)表达和成骨细胞增殖[19]。

Yadav等[8]研究表明，LRP5通过调节5-HT的水平，从而影响骨代谢，上述过程主要发生在十二指肠，而不是骨内；Cui等[11]研究表明，在肠干细胞(产生5-HT的肠嗜铬细胞的干细胞)，两种截然不同的HBM LRP5突变，并没有产生HBM表型；缺失LRP5纯合子小鼠在这些肠干细胞没有显型表达；HBM LRP5等位基因表达的小鼠与野生型小鼠的5-HT循环水平未发现明显差异。同时发现，HBM骨密度增加，敲除骨细胞的LRP5会导致骨量减少；四肢骨细胞中LRP5基因突变表达会造成骨量改变，椎骨则没有。降低循环和肠内5-HT水平，并不影响皮质或骨小梁质量；也不影响骨形成的生化标记物[20]。

基于上述争议，Korvala等[21]利用体外细胞培养进一步研究LRP5新发突变在LRP5产生、Wnt信号通路和Tph1及HTR1B基因表达中的效应。18个无成骨不全(Osteogenesis imperfecta，OI)特性的原发性儿童骨质疏松症患者，LRP5两个新发突变(c.3446T>A；p.L1149Q和c.3553G>A；p.G1185R)被确定存在于2个患者和其家族成员中。体外分析表明，新突变与之前报道的突变(p.C913fs，p.R1036Q)显著降低经典Wnt信号通路活动。结果导致骨形成减少，骨表型变化。肠源性LRP5曾被证实可通过调节Tph1的表达，进而调节5-HT的合成。而此研究表明，LRP5突变没有影响Tph1表达，只有一种突变(p.L1149Q)降低了HTR1B的表达。同时Boudin等[22]评估HTR1B和Tph1在颅骨肥大(一组单基因硬化性骨病)发展中的作用。他们对53例缺乏已知致病基因LRP5，LRP4和SOST突变的2个基因编码区进行筛选，并没有发现致病变异编码区。因此，尚不能证明Tph1和HTR1B在测试患者人群中对硬化性骨病的重要影响。

5 小 结

为什么不同研究机构的研究结果差异如此之大，目前还不清楚。可能归因于Cre重组酶在小鼠启动子定位的差异，以及基因结构、小鼠模型、测量骨密度的方法、骨测试的方法、小鼠的生长环境和5-HT测定技术的不同等。LRP5究竟如何调节骨量？是直接调节成骨细胞谱系细胞，还是通过内分泌或旁分泌信号间接调节？有待进一步深入研究。

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