PTEN与MMP-2在非小细胞肺癌中的临床意义

鲍振学 毛桂玲 刘云云

PTEN(phosphatase and tensin homologue，PTEN)基因是一种具有双特异性磷酸脂质酶活性的抑癌基因，是一类与肿瘤的发生、增殖及侵袭转移有关的基因，其在PI3K/PTEN/AKT信号通路中起关键性调控作用，PTEN基因的失活可能在肿瘤的发生、发展以及侵袭转移中起到重要的作用。MMP-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)是Zn2+依赖性的内源性的蛋白水解酶，参与细胞外基质的降解，与肿瘤的侵袭转移密切相关。本研究采用流式细胞术的方法，检测了肺癌组织与相应癌旁正常肺组织中PTEN、MMP-2蛋白的表达情况，分析其与肺癌临床病理特征及预后的关系，探讨PTEN、MMP-2在NSCLC中表达的意义及预后价值，为NSCLC的治疗探索新途径。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集我院2009至2012年确诊为原发性支气管肺癌手术切除标本73例(肺癌组)，男36例，女37例;年龄33～73岁，平均57.6岁。所有标本均经HE染色病理证实。按照AJCC和UICC分期委员会1997年公布修订的分期标准，鳞癌39例，腺癌34例;高分化25例，中分化26例，低分化22例;Ⅰ、Ⅱ期38例，Ⅲa、Ⅲb期35例;有淋巴结转移35例，无淋巴结转移38例。全部病例术前未接受过放疗、化疗。对照组73例取自对应癌旁正常肺组织(距癌灶边缘5 cm以外)。所有病例均有完整随访资料，随访截止日期为2012年12月，生存期的计算从手术日期到随访截止日期，或由于复发、转移而死亡的日期为止。

1.2 流式细胞术检测方法

1.2.1 免疫荧光染色样品的制备:切取组织块，网搓法制备单细胞悬液。取1×106/ml细胞悬液，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后悬浮于染色液(PBS+0.1%tritonX－100+10%山羊血清)中30 min，用来增加细胞膜的通透性以及封闭非特异性抗体结合部位。间接免疫荧光法标记，加入染色液1∶50稀释的兔抗人PTEN抗体(美国Epitomics公司)和鼠抗人MMP-2抗体(北京中山公司)各 40 μl，37℃孵育60 min。PBS 洗涤，分别加入染色液1∶50稀释的间接免疫荧光标记物荧光素异硫氰酸盐(fluorescein isothiocyanate，FIT)标记的二抗40 μl，避光室温孵育30 min，PBS洗涤，除去未结合的荧光抗体，将细胞重新悬浮于1 ml PBS中，过滤后上机检测。每次检测以同一患者正常肺组织作为正常对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。

1.2.2 流式细胞仪检测方法:采用美国BD公司生产的FACS420型流式细胞仪，激发光源为2 W氩离子激光器，输出功率300 mW，激发波长为488 nm，进行单参数检测。所测数据、图形输入HP-300Consort30计算机，应用相应软件处理，测量前以鸡红细胞作为标准品调校仪器的CV值在5%以内。

1.2.3 PTEN和MMP-2表达的定量分析:以荧光指数(FI)表示它们的相对含量，公式:FI=(样品基因蛋白表达的平均荧光强度－阴性对照的平均荧光强度)/阴性对照的平均荧光强度。FI＞1.0为PTEN阳性表达，FI≤1.0 为阴性表达。

1.3 随访 通过电话调查、信件随访及入户调查的方式了解73例肺癌患者从手术之日起2年内是否存活、存活时间及其死亡原因。

1.4 统计学分析 应用SPSS 13.0统计软件，计量资料以表示，采用t检验或F检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NSCLC与癌旁正常肺组织中PTEN、MMP-2蛋白表达比较 在肺癌组织中PTEN蛋白表达，低于癌旁正常肺组织(P＜0.05)。MMP-2蛋白表达量，高于癌旁正常肺组织(P＜0.05)。见表1。

表1 2组PTEN与MMP-2蛋白表达比较n=73，±s

表1 2组PTEN与MMP-2蛋白表达比较n=73，±s

组别 PTEN t值 P值 MMP-2 t值 P值肺癌组1.85 ±0.14 4.568 0.045 1.15 ±0.28 9.168 0.012对照组1.30 ±0.17 1.56 ±0.57

2.2 PTEN、MMP-2蛋白表达与NSCLC临床病理特征的关系 PTEN、MMP-2蛋白表达与患者的性别、年龄、吸烟史、肿瘤瘤体大小、病理分型均无关(P＞0.05)。在TNM分期中，Ⅰ+Ⅱ期肺癌组织中PTEN蛋白表达高于Ⅲa+Ⅲb期(P＜0.05);肺癌高分化者PTEN蛋白表达量高于低分化者(P＜0.05)，术后生存期＜2年者PTEN蛋白表达量低于≥2年者(P＜0.05);有淋巴结转移者PTEN蛋白表达量低于不伴有淋巴结转移者(P＜0.05)。MMP-2蛋白的表达量随着TNM分期增加而增加(P＜0.05)，分化程度越低表达量越高(P＜0.05)，术后生存期＜2年者MMP-2蛋白表达量高于生存期≥2年者(P＜0.05);有淋巴结转移者MMP-2蛋白表达量高于不伴有淋巴结转移者(P＜0.05)。见表2。

表2 肺癌组织中PTEN和MMP-2蛋白表达与临床病理特征的关系

3 讨论

PTEN是迄今发现的第一个具有双重特异性磷脂酶活性的抑癌基因，PTEN蛋白能负向调控包括AKT及ERK信号通路在内的多种细胞内信号传导通路，从而调节细胞正常的生长、发育及抑制肿瘤细胞增殖、粘附和转移。PTEN是近年来人们发现的新抑癌基因，在多种肿瘤如结直肠癌、黑色素瘤、甲状腺癌、乳腺癌中表达减少或缺失［1－4］。本研究结果显示，PTEN在肺癌中的表达量显著低于癌旁正常肺组织。随着TNM分期的增加，PTEN的表达量降低，分期越晚，表达量越低;随着肺癌的分化程度越差，PTEN的表达量就越低;PTEN的表达量水平随着肺癌淋巴结转移的发展而呈现下调的趋势，并且PTEN表达量低者生存期短，说明PTEN参与了肺癌的发生及侵袭转移过程。

肿瘤浸润和转移的重要条件是细胞外基质及基底膜的降解，MMP-2在降解基底膜过程中起着重要作用［5］，有研究表明在许多肿瘤组织如胃癌、结直肠癌、肝癌、乳腺癌中，MMP-2过表达与肿瘤的发生发展密切相关［6－8］。本研究结果显示，MMP-2在肺癌组织中的表达量显著高于癌旁正常肺组织。MMP-2的表达量与TNM分期有关，分期越晚，表达量越高;随着肺癌分化程度的降低，MMP-2的表达量越高;MMP-2的表达水平随着肺癌淋巴结转移而呈现上调的趋势，并且MMP-2高表达者生存期短，说明MMP-2的高表达与肺癌的不良预后有关。

Tian等［9］研究发现，在肝癌中，过表达的PTEN可抑制肝细胞中MMP-2的表达，PTEN可通过PI3K/AKT/MMP-依赖的方式来抑制肝癌细胞的侵袭转移。本研究发现，PTEN在肺癌组织中表达量减弱或缺失，MMP-2的表达量增加，造成了MMP-2蛋白过剩，从而促进了肺癌细胞的侵袭转移，其机制可能与PTEN对MMP-2的抑制作用减弱有关。

总之，对PTEN及MMP-2表达的检测可作为评估肺癌患者淋巴结转移及预后的指标，PTEN作为一种肿瘤转移抑制基因，有望成为治疗肺癌侵袭转移的新靶点。

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9 Tian T，Nan KJ，Guo H，et al.PTEN inhibits the migration and invasion of HepG2 cells by coordinately decreasing MMP expression via the PI3K/Akt pathway.Oncol Rep，2010，23:1593-1600.