遗传性泛发性色素异常症ABCB6基因突变检测

刘 丹付希安暴芳芳史本青刘 红田洪青张福仁∗

·经验交流·

遗传性泛发性色素异常症ABCB6基因突变检测

刘 丹1，2，3付希安1暴芳芳1史本青1刘 红1田洪青1张福仁1∗

目的: 检测3例遗传性泛发性色素异常症患者ABCB6基因的突变。方法: 提取患者外周血DNA，采用PCR扩增患者ABCB6基因的全部外显子及其侧翼序列，对PCR扩增产物直接测序检测基因突变。结果: 3例患者该基因编码区所有外显子均未发现突变。结论: 本研究中3例遗传性泛发性色素异常症患者的发病与ABCB6基因的编码区序列无关。

遗传性泛发性色素异常症； ABCB6基因； 突变位点

遗传性泛发性色素异常症(DUH)是由德国学者Lchikawa和Hiraga于1933年首次报道的一种少见的孟德尔遗传性皮肤病，其典型皮损为全身泛发相互夹杂的色素沉着和色素减退斑。1本病呈常染色体显性或隐性遗传。DUH作为一种遗传性疾病，其表型改变是以基因的改变为基础，因此寻找其致病基因不仅可以对疾病做出明确诊断，而且可以在分子水平更好的认识其发病机制。2003年贺林等首次将显性遗传DUH的致病基因定位于6q24.2～q25.2区域，2隐性遗传DUH的致病基因定位于12q21～q23区域。3，42013年Zhang等运用全基因组联合分析及外显子测序的方法首先发现ABCB6基因为DUH的致病基因。5同时，我们的研究团队也运用相似的方法得出相同的结论，并且用模式动物斑马鱼实验验证致病基因ABCB6的表达。6为进一步验证ABCB6为DUH的致病基因，我们对收集到的2个DUH家系的先证者及1例散发共3例患者进行ABCB6基因突变位点检测。

1 资料与方法

1.1 研究对象 3例DUH患者来自山东省皮肤病性病防治研究所门诊，均经临床和病理确诊。2个DUH家系的家系图如图1所示:患者父母之一发病，男女发病机会大致均等；男女患者均可直接传递给后代且代代相传，符合单基因遗传中常染色体显性遗传的方式。家系中先证者及1例散发病例的平均发病年龄为2岁。典型的临床表现:全身泛发大小性状不等色素斑，色素沉着与色素减退相互夹杂，无自觉症状(图2)。组织病理学示:色素沉着区基底细胞甚至真皮层黑素增加；色素减退区黑素数量明显减少甚至缺如(图3)。

图1 家系图(a:家系1；b:家系2)

图2 a、b:散发病例的肩部及背部泛发大小形状不等色素斑，色素沉着与色素减退相互夹杂图3 散发病例背部组织病理示:色素沉着区基底细胞甚至真皮层黑素增加；而色素减退区黑素数量明显减少(HE，×400)

1.2 材料 经患者知情同意后，留取详细的临床资料和临床图片及组织病理检查结果，同时取患者静脉血各5 mL，放置在EDTANa4抗凝管中，存入－70℃冰柜冷冻保存，采用AXYGEN试剂盒提取基因组DNA。取适量DNA进行纯度检测并标化。

1.3 方法

1.3.1 PCR扩增 通过美国国家生物信息中心(NCBI)基因库及UCSC数据库检索到ABCB6基因的基因组序列，采用Premier Primer 5.0软件设计合适的引物，由北京华大基因科技有限公司合成(表1)。按照说明书将其稀释为20μmol/L，并采用温度梯度法探索每一对引物的最佳退火温度。PCR反应在9700型PCR扩增仪(美国ABI公司)上完成，反应条件为: 94℃预变性3 min后，94℃变性30 s，退火45 s，72℃延伸45 s，共35个循环。最后72℃延伸8 min，4℃保存。

表1 本研究中设计的引物

1.3.2 DNA测序 PCR产物采用3130xl遗传分析仪(美国ABI公司)直接测序。

2 结果

直接测序结果ABCB6基因整个编码区的19条外显子及其侧翼序列被扩增，并且个别外显子采用了双向测序，以确保测序结果的准确性。3例患者的DNA测序结果中均未发现突变位点(图4为散发病例12号外显子的一段正常序列)。

图4 散发病例12号外显子的一段正常序列，箭头所指为文献5中报道的突变位点c.1736 G＞A(p.Gly579Glu)

3 讨论

DUH是一种少见的色素异常性皮肤病，其典型皮损为全身泛发色素沉着伴色素减退斑。该病的诊断主要依靠临床表型及组织病理学检查，但临床存在许多与其表型相类似的色素异常性疾病，如遗传性对称性色素异常症(DSH)、网状肢端色素沉着(RAPK)、屈侧网状色素异常症(DDD)等，给临床诊断带来一定困难。而遗传性疾病的表型改变往往以基因的改变为基础，因此确定疾病的致病基因尤为重要。

早在2003年贺林等就首次将显性遗传及隐性遗传DUH的致病基因分别定位于6q24.2～q25.2和12q21～q23区域，但均未发现致病基因。

2013年Zhang等5首先通过连锁分析及相关的功能分析发现该病的致病基因为ABCB6且该基因在皮肤的表皮表达。Cui等7通过连锁分析及外显子测序技术进一步验证了ABCB6基因为DUH的致病基因，并认为不同位置的突变位点可以产生不同的表型。

ABCB6基因位于2号染色体2q36区域，属于ABC转运超家族，参与转运多肽、类固醇等。8该基因表达于多种组织，如心脏、骨骼肌、黑素细胞及黑素瘤细胞等。8ABCB6亚细胞定位于内质网、高尔基体、溶酶体及质膜。9，10既往研究发现DUH可能与黑素细胞成熟障碍相关。我们的动物模式斑马鱼实验表明ABCB6在黑素的转运及生成方面发挥着极其重要的作用。6

迄今已发现7个DUH相关的ABCB6基因突变位点(表2)，但本研究中3例患者所有ABCB6基因编码区域及侧翼序列均未发现突变。我们推测可能的原因:一是突变位点可能位于启动子区域，而我们并没有检测所有的内含子区域。二是该病可能存在其他致病基因。下一步我们会对非编码区进行测序，检测内含子区域是否存在突变。

表2 文献中报道的关于显性遗传DUH的致病基因ABCB6突变位点

1 Ichigawa T，Hiraga Y.A previously undescribed anomaly ofpigmentation dyschromatosis universalis hereditaria.J Dermatol，1933，34:360－364.

2Xing QH，Wang MT，Chen XD，etal.A gene locus responsible for dyschromatosis(DSH)maps to chromosome 6q24.2－q25.2. Am JHum Genet，2003，73:377－382.

3 Bukhari IA，El－Harith EA，Stuhrmann M.Dyschromatosis universalis hereditaria as an autosomal recessive disease in five members of one fam ily.JEur Acad Dermatol Venereol，2006，20 (5):628－629.

4 Stuhrmann M，Hennies HC，Bukhari IA，et al.Dyschromatosis universalis hereditaria:evidence for autosomal recessive inheritance and identification of a new locus on chromosome 12q21－q23.Clin Genet，2008，73(6):566－572.

5 Zhang C，LiD，Zhang J，etal.Mutations in ABCB6 Cause Dyschromatosis Universalis Hereditaria.J Invest Dermatol，2013，133 (9):2221－2228.

6 Liu H，Li Y，Hung KKH，et al.Genome－wide linkage，exome sequencing and functional analyses identify ABCB6 as the pathogenic gene of dyschromatosis universalis hereditaria.PLoSOne，2014；9(2):87250.

7 Cui YX，Xia XY，Zhou Y，etal.Novelmutations of ABCB6 associated with autosomal dominant dyschromatosis universalis hereditaria.PLoSOne，2013，8(11):79808.

8Mitsuhashi N，Miki T，Senbongi H，et al.MTABC3，a novel mitochondrial ATP－binding cassette protein involved in iron homeostasis.JBiol Chem，2000，275:17536－17540.

9 Tsuchida M，Emi Y，Kida Y，et al.Human ABC transporter isoform B6(ABCB6)localizes primarily in the Golgi apparatus. Biochem Biophys Res Commun，2008，369(2):369－375.

10 Kiss K，Brozik A，Kucsma N，etal.Shifting the paradigm:the putativemitochondrial protein ABCB6 resides in the lysosomes of cells and in the plasma membrane of erythrocytes.PLoS One，2012，7(5):37378.

(收稿:2014－03－20 修回:2014－05－04)

M utation detection of ABCB6 gene w ith dyschromatosis universalis hereditaria

LIU Dan，FU Xi-an，BAO Fang-fang，et al.Shandong Provincial Institute of Dermatology and Venereology，250022，Jinan

Objective:To identifymutations of ABCB6 gene in three patientswith dyschromatosis universalis hereditaria.Methods:After extracting DNA from peripheral blood，all the exonsof ABCB6 geneand their flanking intronic sequences were amplified by PCR，and then，direct sequencing was performed to screen the mutations in the gene.Results:Nomutation was found in any of the exon in ABCB6 gene from the three patients.Conclusion:The pathogenesis of the three patients with dyschromatosis universalis hereditaria has nothing to do with the sequence of coding region in ABCB6 gene.

dyschromatosis universalis hereditaria；ABCB6 gene；mutations

1山东省皮肤病性病防治研究所，济南，250022

2山东省医学科学院，济南，250062

3济南大学山东省医学科学院医学与生命科学学院，济南，250062

∗通信作者