缺血修饰白蛋白检测方法的分析性能评价

苏汉文，李栋，陈永勤

（1.武汉大学人民医院检验科，湖北武汉430060；2.湖北大学生命科学学院，湖北武汉430062）

0 引言

冠心病已成为严重威胁人们健康的疾病.冠心病的病理基础是冠状动脉内不稳定斑块形成血栓，导致冠状动脉急性完全或不完全栓塞，其最常见的发病机制是心肌缺血.传统的检测指标心电图、心肌血清学标志物以及影像学技术作为心肌缺血早期诊断的指标，其敏感性偏低［1－2］；另一方面，临床上早期心肌缺血如果能够及时发现并予以有效干预，则能在很大程度上避免不可逆的心肌坏死的发生.因此，寻找一种对心肌缺血具有很好的敏感性和特异性，在不可逆性心肌坏死发生之前，能尽早反映心肌缺血的标志物，具有十分重要的意义.

缺血修饰白蛋白（ischemia modified albumin，IMA）是近年来研究较多的心肌缺血检测项目，能在心肌缺血发生后5～10min迅速升高，并在缺血过程中持续升高［3］，美国FDA于2003年批准其用于临床诊断心肌缺血，目前国内外尚未建立统一的健康人群IMA参考区间和诊断阈值.本研究采用国产试剂盒和全自动生化分析仪，用白蛋白－钴结合试验（albumin cobalt binding test，ACB test）定量检测IMA，旨在评价IMA检测方法的分析性能、建立IMA临床参考区间，为其临床应用提供指导.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 仪器与试剂 由OLYMPUS AU5400全自动生化分析仪（日本OLYMPUS公司）和缺血修饰白蛋白试剂盒（湖南长沙颐康科技开发有限公司生产，双液体试剂：Rl：CoCl2及稳定剂等组成；R2：显色剂DTT和稳定剂等组成，批号：201052741）为主组成IMA检测系统.标准品浓度为61.8U／mL（批号：20101250）校准品和质控品（批号：20102251）采用试剂盒内配套校准品和质控品，保证检测系统测定样品期间每日室内质控为在控状态.

1.1.2 研究对象 研究对象为2011年3月—2011年9月来武汉大学人民医院健康体检的人群.随机选择366人，男206人，女160人，平均年龄（49.5±12.6）岁.入选标准：表征健康个体作为参考个体，要求参考个体肝肾功能、血压、心肺功能正常；排除标准：有下列情况之一的个体：贫血、胸痛、心律不齐、心脏病、动脉粥样硬化、高血压、外周血管疾病、气管及支气管炎症、支气管扩张症、肺炎等呼吸系统疾病、糖尿病、肿瘤.

1.1.3 血清样品的采集 按照实验室静脉采血的标准操作程序，于清晨采集研究对象空腹静脉血5mL，用带分离胶的促凝管（美国BD公司生产）分装，15min后3 000r／min离心5min，分离血清，－20℃密封保存，溶血和脂血血清样品被剔除.

1.2 方法

1.2.1 IMA含量的检测方法（ACB test） ACB实验反应原理为白蛋白－钴结合试验，其原理为正常情况下，HSA的N－末端能够和氯化钻溶液中的钴离子（Co2＋）结合从而降低氯化钻溶液中的游离Co2＋浓度，在心肌缺血患者血液中，HAS被修饰转化成IMA，IMA与外源性Co2＋结合能力大幅下降，通过向血清标本中加入一定浓度的氯化钴溶液，待正常的HSA与Co2＋充分结合，溶液中游离的Co2＋则和随后加入的二琉苏糖醇（DTT）发生反应显色，游离Co2＋的浓度与显色强弱成正比，从而间接反应血清标本中IMA水平，IMA水平与显色强度呈正相关.通过分光光度法测定吸光度，吸光度值与游离Co2＋浓度成正比，再通过与白蛋白标准品进行比较，换算出样本中IMA的浓度.检测结果的单位定义为：每毫升血清中的ALB在510nm波长下结合1μg的Co2＋为一个单位.按试剂盒提供的分析参数在分析仪上进行设置，通过校准、室内质控，合格后进行检测.

1.2.2 IMA检测方法ACB的线性实验 参考CLSI EP6－P——定量分析方法线性的评价推荐指南（1986），将白蛋白浓度为60.48g／L的复合校准血清（上海科华生物工程股份有限公司生产，批号：DS0118）进行原倍、1∶2、1∶3、1∶4、1∶6、1∶8倍的稀释，将每份标本平行测定2次，测定的IMA值与对应的白蛋白浓度作线性回归分析.

1.2.3 精密度评估实验 参考美国CLSI文件EP5－A——临床化学设备精密性能的评价批准指南（1999）评价方案要求进行.实验样本的准备：收集表征健康人新鲜混合血清和不同浓度的IMA标本，配制成所需浓度样本：高浓度（85.63U／mL，H）、中浓度（64.25U／mL，M）、低浓度（32.64U／mL，L）的3份，各分装10套（每例样本200μL），－20℃冷冻保存至分析.实验样本的检测：在OLYMPUS AU5400全自动生化分析仪上，用湖南长沙颐康科技开发有限公司的IMA检测试剂盒连续检测3种浓度样本IMA各20次以评估批内不精密度；每天取出L、M、H样本各1套，早晚各检测1次，连续检测10d，评估批间不精密度.分别计算批内、批间检测值的均值（¯χ）、标准差（s）及精密度（CV）.

1.2.4 白蛋白－钴结合实验抗干扰实验 参考CLSI EP7－P——临床化学干扰试验推荐指南（1986）评价方案，采用“配对差异”的实验方法.选取一例血清标本1 200μL，平均分成2份组成A、B两组各3份（每份200μL），A组分别加入不同浓度的干扰物：血红蛋白、胆红素、甘油三酯各200μL，干扰物浓度为：血红蛋白160g／L、胆红素75.2mmo1／L、甘油三酯8.5mmo1／L（通常情况下临床标本可能出现的最高含量）；B组每份各加入200μL蒸馏水.将每组的标本各重复测定10次，用A组的均值减去相应B组的均值即可得干扰值.B组浓度±1.96 SD作为判断有无干扰的阈值.本实验选取IMA为32.64U／mL和85.63U／mL的两个浓度水平进行干扰实验.

1.2.5 参考区间的确立 按照C28－A2——临床实验室等机构提供建立、转移和验证参考区间的方法指南文件的要求选择参考人群，然后应用Olympus AU5400全自动生化分析仪，采用ACB实验测定血清IMA，经统计分析获取IMA的参考区间.

1.3 统计学分析 白蛋白－钴结合线性试验的相关性采用曲线拟合（curve estimation），回归方程用线性回归分析；计量资料两组间均数比较用独立样本t检验；各组间均数的比较用Z检验，行单因素方差分析（one－way ANOVA），以P＜0.05定义为差异有统计学意义.

2 结果

2.1 白蛋白－钴结合线性实验结果 ACB测定不同浓度白蛋白结果呈线性，白蛋白－钴结合线性分析方程式为：y＝1.470 6x＋5.260 6，R2＝0.974 8，表明在白蛋白7.56～60.48g／L范围内白蛋白与钴结合线性良好，见图1.

2.2 精密度试验结果 检测方法的精密度对检测结果的稳定性至关重要，因此分析方法的性能评价必须对其批内和批间精密度进行严格的评价.通常以检测结果的变异系数来反应精密度.本文中对高、中、低3个IMA浓度血清的IMA进行批内和批间的检测结果分析见表1.由表1可知，高、中、低3个样本的IMA含量检测的批内变异系数和批间变异系数分别为3.01%和3.24%、2.63%和4.36%、4.77%和5.59%，均小于厂商说明书声明的5.06%和6.72%，表明本实验检测系统精密度性能符合临床实验室质量目标管理的要求.

图1 白蛋白－钴结合线性分析

表1 ACB法检测IMA检测系统的精密度

2.3 白蛋白－钴结合干扰实验 临床化学实验室常见的干扰来至于检测样本，样本溶血、黄疸以及脂血是最常见的干扰因素.本文中选择IMA为32.64U／mL和85.63U／mL的低高两个浓度水平标本来研究其干扰实验，两个浓度样本的血红蛋白、胆红素、甘油三酯干扰实验结果分别为：34.52±2.01U／mL、34.01±1.98U／mL、30.68±2.11U／mL和86.12±2.68U／mL、85.76±2.84U／mL、82.35±2.73 U／mL，均分布在对照组结果的95%置信区间28.89～36.26U／mL和77.73～87.38U／mL内，参考CLSI EP7－P评价标准表明该方法在本临床实验室检测系统中抗干扰性能良好.

2.4 参考区间的建立

2.4.1 参考个体组成情况 排除Alb低于30.0g／L、ALT、Glu、Crea、TG、Chol和ECG异常的体检者，本实验最后入选的参考个体共366例，其中男性206例，女性160例，年龄范围为15～75岁，平均年龄49.5岁.符合C28－A2文件要求的最低120例标准.

2.4.2 离群值的处理 按照C28－A2文件要求，需要对离群值进行处理.观察所有实验数据发现，存在3个疑似离群点，参照C28－A2文件，将其与邻近点的差值D（4.85）与数据全距R（16.25）相除，D／R＝0.298＜1／3，故不认为该点为离群点，保留所有测定数据.

2.4.3 不同性别IMA检测结果分析 医学参考区间的建立，通常要考虑人群的性别、年龄、种族等因素.为比较人群中男性和女性IMA结果，本文将366例检测结果按性别分成两组.经Z检验，同时作方差分析，结果见表2.从表2可以看出，Z检验的z值小于z＊，并且男性与女性的标准差之比小于1.5，即男性和女性检测结果的差异无临床实际意义；男性和女性的IMA检测结果方差齐性，进行统计学分析（P＞0.05）显示无统计学差异.因此本实验的参考区间不需要按照性别差异分开计算.

2.4.4 按年龄分组的IMA检测结果分析 因为男性和女性的IMA检测结果的差异无临床意义，现按年龄分组计算各组的IMA检测结果均值和标准差，并做统计分析.结果表明，不同年龄组间的IMA值也无统计学差异（各组间比较，P＞0.05，见表3），因此在分析IMA的参考区间时不需要考虑年龄因素.2.4.5 IMA检测数据的频数分布图 分析366例参考个体，其中最低的IMA值为60U／mL，最高为85 U／mL.参照C28－A2文件，对366例检测数据进行统计，绘制IMA检测数据的频数分布图（图2），显示参考人群血清IMA值的分布情况.进行分布正态性检验，偏度系数为－0.13，峰度系数为1.388，说明数据呈偏态分布（P＜0.05）.其中频数最高的测定值为65.00U／mL.所有数据的算术平均数为69.885 3U／mL，标准差为5.326 8U／mL.

图2 缺血修饰白蛋白测定结果的频数分布图

表2 不同性别间IMA（U／mL）检测结果

表3 不同年龄组IMA（U／mL）检测结果（s）

表3 不同年龄组IMA（U／mL）检测结果（s）

各组间比较，P＞0.05.

分组 年龄区间／岁 样本数n IMA值（¯χ±s）43 64.83±5.47 105 64.39±6.58 3 46～60 108 69.24±5.90 4 61～70 80 67.24±5.68 5＞70 30 70.86±5.72

2.4.6 确立IMA的参考区间 采用百分位点法计算：根据IMA理论上的临床意义，IMA的参考区间只需考虑单边，参照CA28－A2文件，按统计学第5%位点的值为65.20U／mL，因此IMA的健康人群参考区间为IMA＞65.20U／mL.

3 讨论

缺血修饰白蛋白（IMA）作为心肌缺血辅助诊断指标，对心肌缺血灵敏度很高，且在心肌缺血5～10min后即可检测到，在心肌缺血过程中一直存在，其定量检测结果对早期心肌缺血的诊断具有十分重要的意义，已逐步应用于临床［4－5］.

本研究使用湖南长沙颐康科技开发有限公司的IMA检测试剂和OLYPAUS AU5400全自动生化分析仪组成检测系统，按照试剂说明书提供的分析参数，在生化分析仪上设置分析参数.为保证国产试剂检测结果的质量，本研究参照CLSI系列文件，对该检测系统进行了分析性能评价和验证.参照EP6－P文件的要求，进行白蛋白与钴离子结合线性实验性能评价，结果表明在白蛋白7.56～60.48g／L范围内，白蛋白与钴离子结合具有良好的线性，线性方程为：y＝1.470 6x＋5.260 6，R2＝0.974 8.人群中白蛋白通常在20～60g／L范围内，因此本线性实验为开展临床标本检测做好了基础性准备.按照CLSI的要求，参照EP5－A文件的要求，对建立的IMA检测系统进行测量精密度评价，结果显示该检测系统精密度高、中、低值样本的批内CV和批间CV，均低于试剂厂商说明书声明的5.06%＆6.72%，符合临床实验室质量目标管理的要求，从而保证检测结果的稳定性和重复性.

抗干扰能力的高低是评价检测方法分析性能的重要指标.为评价本检测方法的抗干扰能力，参考CLSI EP7－P评价方案，采用“配对差异”的实验方法，评价在临床上可能出现的常见检测干扰物：血红蛋白（当检测标本准备过程中出现溶血时）、胆红素（病人出现黄疸时）和甘油三酯（当患者出现高脂血症、或者进食高胆固醇、高蛋白饮食后）对实验的影响，结果IMA为32.64U／mL和85.63U／mL的两个浓度水平的血红蛋白、胆红素、甘油三酯干扰实验结果均分布在对照组结果的95%置信区间内，表明该方法在本临床实验室检测系统中抗干扰性能良好，能满足临床应用需求.

鉴于目前暂没有国人可借用的IMA参考区间，要求要用户根据自己实验室的检测系统，建立合适的参考区间.C28－A2是为临床实验室、试剂厂商等机构提供建立、转移和验证参考区间的方法指南，本研究参照该文件建立本实验室的参考区间.本研究纳入统计的样品366例，男性206例，女性160例，男性和女性的IMA检测结果方差齐性，进行统计学分析（P＞0.05）显示无统计学差异，这与相关报道一致［6－7］.男性和女性检测结果的差异无临床实际意义，因此本实验的参考值不需按照性别差异分开计算.按年龄分组计算各组的IMA检测结果均值和标准差，并做统计分析，各年龄段组的IMA无显著性差异，因此不需要考虑年龄因素.所有结果IMA正态性检验偏度系数为－0.12，峰度系数为1.379，表明数据呈偏态分布（P＜0.05）.其中，测定值为65.00U／mL的频数最高.根据IMA的理论临床意义，确定IMA的健康人群参考区间为IMA＞65.20U／mL.

本实验的局限性在于为单中心的研究，参考个体涵盖面有限.根据C28－A2文件的要求，若能进行多中心研究，则能获取更客观的参考值数据，因为不同医学实验室合作建立的参考区间，其样本量较大，与医学实验室单独建立的参考区间相比，能减少不同医学实验室参考区间之间的离散性［8］，这样得到的参考区间更加客观，对临床医生的指导意义更大.因此，可在后续的研究中考虑不同地点、不同采血季节等因素，尽可能使统计结果反映健康群体的真实状态.各医学实验室应用于临床之前，应按C28－A2文件程序进行参考区间验证，即用20例健康人的血清检测IMA，不超过2例的IMA检测值在参考区间外则验证成功.

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