细菌纤维素产生菌的筛选、鉴定及其产物分析

邓毛程，王 瑶，李 静，吴永辉，张远平

（1.广东轻工职业技术学院 食品与生物工程系，广东 广州 510300；2.广州倚德生物科技有限公司，广东 广州 510300；3.广州甘蔗糖业研究所，广东 广州 510316）

0 引言

细菌纤维素（Bacterial cellulose，简称BC）是由微生物（主要是细菌）合成的细胞外纤维素，在结晶度、化学纯度、抗张强度、弹性模量、吸水性和生物相容性等方面均优于植物纤维素，被认为是一种性能优异的新型天然生物纳米材料[1-2].近年来，细菌纤维素的研究成为当今微生物合成材料领域的热点之一，并在生物医药、组织工程支架材料、声学器材、食品、化妆品、造纸等领域展现出巨大的应用潜力[3-4].但是，自从1886 年英国科学家Brown[5]发现细菌纤维素以来，由于细菌纤维素生产一直处于发酵产率低、生产成本高的状况，使其应用受到很大的局限[6].为了提高细菌纤维素的发酵产率，笔者从自然发酵的椰子水中筛选、鉴定细菌纤维素高产菌株，并对其发酵产物进行分析，期望能够为细菌纤维素的研究和生产提供优良菌种.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

筛选材料：经自然发酵产膜的椰子水，采样于海南省；新鲜椰子水：成熟椰子破壳取水；DNA 提取试剂盒、16S rDNA 的扩增引物以及PCR 扩增试剂等：深圳华大基因科技服务公司；其他试剂均为市售.

1.2 仪器与设备

SPX-100B-Z 型生化培养箱：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；TS-211C 型振荡培养箱：上海天呈实验仪器制造有限公司；SHZ-82A 型恒温水浴振荡器：江苏省太仓医疗器械厂；KDC-210HR 高速冷冻离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司；S-3000N 扫描电镜：日本日立公司；VERTEX70 傅立叶红外光谱仪：德国布鲁克公司.

1.3 平板分离

固体培养基：葡萄糖20 g/L，酵母膏10 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，琼脂20 g/L，新鲜椰子水50%（V/V），调节pH 至5.5，121 ℃灭菌20 min.按固体培养基配方制备平板，备用.在无菌条件下，将表面的菌膜从自然发酵椰子水中取出，剪取2 g 放入无菌试管中，加入10 mL 无菌水，置于涡旋振荡器上振荡5 min，再将悬液进行梯度稀释，涂布于平板培养基上，于30 ℃恒温培养72 h，观察菌落形态，然后挑取颗粒饱满的单个菌落，接入斜面培养基进行培养和保藏.

1.4 发酵筛选

液体培养基：葡萄糖50 g/L，酵母膏10 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，新鲜椰子水50%（V/V），调节pH 至5.5，121 ℃灭菌20 min.将液体培养基分装至250 mL 三角瓶中，每瓶装液100 mL，121 ℃灭菌20 min，冷却后，将挑取菌落的斜面菌种接入液体培养基，每瓶接入1 环，恒温30℃静置培养240 h，观察各菌株的产膜情况，并测定各瓶的细菌纤维素产量，根据测定结果优选出目标菌株.

1.5 菌种鉴定

采用革兰氏染色显微镜观察法和扫描电镜观察法[7]鉴定菌种形态特征；按照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰细菌鉴定手册》（第八版）的方法[8-9]，鉴定菌种的生理生化特征；参照文献[10]的方法，对菌种的16S rDNA 进行鉴定.在16S rDNA鉴定过程中，采用1 对通用引物（5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′和5′-AGA AAG GAG GTG ATC CAG CC-3′）对菌种的16S rDNA 进行扩增，PCR 产物送至深圳华大基因科技服务公司测序，然后在NCBI（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov）中进行同源性检索，并采用MEGA5.1 软件以Neighborjoining 法构建系统发育树.

1.6 产物定性分析

用清水将目标菌株的凝胶膜状产物洗净，浸泡于0.1 mol/L 的NaOH 溶液中煮沸30 min，用蒸馏水漂洗至中性，再置于105 ℃下进行干燥.产物的初步定性分析采用蒽酮显色法[11]，即称取干燥后的产物0.1 g，加入2～4 ℃60%硫酸溶液100 mL，于冰浴中消化2 h，然后在比色管中分别加入消化液4 mL 和2%蒽酮1 mL，观察显色结果.另外，产物特征官能团的分析采用傅里叶红外光谱（FTIR）法[12-13]，即将干燥后的产物与KBr 混合，研磨成粉末，经压片，通过傅里叶红外光谱仪在4 000～400 cm-1区间内进行扫描，测定产物的红外吸收光谱，分析产物的官能团特征.

1.7 产物结构分析

参照文献[14]的扫描电镜法，利用扫描电镜观察产物的微结构.

1.8 细菌纤维素产量的测定

采用称重法[15]测定细菌纤维素的产量，即用清水将凝胶膜状产物洗干净，放入0.1 mol/L NaOH溶液中煮沸30 min，用蒸馏水漂洗至中性，于105℃的条件下干燥至恒重，然后准确称量干燥物的质量.

2 结果与讨论

2.1 菌种的筛选

从分离平板上挑取颗粒饱满的菌落52 个，经过发酵复筛试验，其中凝胶膜产量居于前9 位菌株的发酵结果如图1 所示.可以看出，这9 种菌株的细菌纤维素产量分布在4.52～10.80 g/L 的范围内，产量排序为：BC13＞BC07＞BC19＞BC26＞BC10＞BC28＞BC02＞BC37＞BC41.菌种BC13 的细菌纤维素产量最大，故被确定为进一步研究的优选菌种.

图1 9 种菌株的细菌纤维素产量

2.2 菌种形态与生理生化特性的鉴定

经革兰氏染色和显微镜观察，菌种BC13 呈阴性.如图2 和图3 所示，在透射电镜（×7 000）和扫描电镜（×10 000）下观察，菌体呈椭圆的杆状，大小为（0.4～0.6）μm ×（1.3～2.8）μm，周生鞭毛.菌种BC13 的生理生化特征试验结果见表1，根据《伯杰细菌鉴定手册》（第八版）和《常见细菌系统鉴定手册》的描述，初步鉴定菌种BC13 为醋杆菌属.

图2 菌种BC13 在透射电镜下的菌体形态（×7 000）

图3 菌种BC13 在扫描电镜下的菌体形态（×10 000）

2.3 菌种16S rDNA 的鉴定

菌种BC13 的16S rDNA 的PCR 扩增产物大小为1 453 bp，将此序列在NCBI 中进行Blast 比较后，发现菌种 BC13 与葡糖酸醋杆菌属（Gluconacetobacter）许多菌种的同源性达99%以上，与其同源性达到100%的葡糖酸醋杆菌有Gluconacetobacter xylinus 1-18（登录号：KF030731.1）和 Gluconacetobacter xylinus G7 -3（登录号：KF030791.1）.如图4 所示，采用Neighbor-joining法构建系统发育树，也可以发现菌种BC13 与Gluconacetobacter xylinus 1-18 的亲缘关系最接近.将菌种BC13 的形态、生理生化等特征与16S rDNA鉴定结果结合起来，可最终确定菌种BC13 为木葡糖酸醋杆菌（Gluconacetobacter xylinus）.

表1 生理生化试验结果

图4 菌种BC13 序列系统发育分析

2.4 产物的定性分析

菌种BC13 的凝胶膜状产物在0.1 mol/L 的NaOH 溶液中煮沸30 min，没有发生溶解；其干燥物经60%硫酸消化和蒽酮试剂显色，呈绿色，这与蒽酮显色法鉴定纤维素的原理吻合，可以初步判断凝胶膜状产物的主要成分为纤维素.发酵产物的红外光谱见图5.由图5 可见，3 584 cm-1处的吸收峰是由O—H 伸缩振动所致，2 896 cm-1处的吸收峰是大分子中C—H 伸缩振动所致，1 664 cm-1处的吸收峰是由纤维素4′端的半缩醛基的伸缩振动所致，1 555 cm-1、1 427 cm-1和1 336 cm-1处的吸收谱带是C—H 的弯曲振动所产生，1 205 cm-1和1 061 cm-1处的吸收谱带是由C—O 的伸缩振动所产生.图5 表明，发酵产物可能含有与纤维素结构相符合的基团，其红外光谱的特征与相关文献中细菌纤维素的红外光谱基本一致[1，6，16]，因而可进一步推断发酵产物是细菌纤维素.

2.5 产物的结构分析

在扫描电镜（×8 000）下观察产物的超微结构如图6 所示.由于经过碱水煮沸处理，几乎没有发现菌体残留在产物中.产物呈现出由微纤维相互缠绕形成的致密网状结构，纤维丝直径不足100 nm.图6 的超微结构与相关文献中细菌纤维素的扫描电镜照片[6，17]十分相似.

图5 菌种BC13 产物的傅里叶红外光谱

图6 菌种BC13 产物的超微结构

3 结论

以自然发酵的椰子水为筛选材料，采用平板分离、静态发酵等方法筛选获得细菌纤维素产量为10.8 g/L 的菌株BC13.经过形态特征、生理生化特征以及16S rDNA 等方面的分析，鉴定菌株BC13为木醋杆菌.采用蒽酮显色法、红外光谱法对菌株BC13 的发酵产物进行定性分析，同时采用扫描电镜对其超微结构进行观察，可推断菌株BC13 的发酵产物为细菌纤维素.菌株BC13 产纤维素能力较高，是一株具有应用潜力的菌株，为了使其更好地应用于细菌纤维素的研究和生产，其发酵工艺仍需进一步优化.

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