河蚬蛋白酶解液制备热反应型酱香调味基料的研究

林 娈，杨 婷

（泉州师范学院 化学与生命科学学院，福建 泉州 362000）

0 引言

河蚬（Corbicula fluminea）又称黄蚬、金蚶、扁螺等，广泛分布在我国湖泊、江河中，天然资源丰富[1].河蚬软体部分干样中，粗蛋白、粗脂肪、灰分含量分别为63.33%、10.91%、6.29%，必需氨基酸占氨基酸总量的39.10%，并富含钙、钠、钾、铁等无机元素[2].河蚬不仅具有较高的营养价值，而且具有开胃、通乳、明目、利尿、去湿毒、治疗肝病、麻疹、退热、止咳化痰、解酒等功效[1].文献[3-4]报道以河蚬为原料，添加不同种类的蛋白酶进行水解，制得水解度较高、气味较好的河蚬蛋白酶解液.作者也尝试先后添加Neutrase/Alcalase（中性/碱性）和Flavourzyme（风味）蛋白酶对河蚬软体部分进行水解，获得的蛋白酶解液鲜味浓郁、无明显腥苦味，但闻香时发现酶解液的香气微弱或基本没有.

食品热反应增香技术，包括氨基酸和还原糖之间的美拉德反应、各氨基酸之间的斯特克雷尔反应以及脂质的降解反应等，其中最主要的是美拉德反应[5].近年来，一些研究者利用美拉德反应，即用蛋白酶水解价廉物美的动植物蛋白、酵母浸膏，将得到的蛋白质酶解产物再与氨基酸、还原糖等共热，生产风味逼真的高档天然营养风味料[6-8].其实质是模拟物质在加热过程中产生风味物质的反应系统，此仿生系统与实际产香系统近似程度越高则反应所产生的香味就越逼真[9].目前国内风味料仿生模型的研究尚属起步阶段，纯粹通过现代生物技术和食品热加工技术生产风味料的成熟技术还未见报道.因此，作者在前期获得的河蚬蛋白酶解液基础上，以风味评分值为指标，探讨初始pH值、还原糖添加量、反应温度和时间对热反应效果的影响，优化热增香反应条件，为进一步开发以河蚬蛋白酶解液为前体的复合调味料提供研究基础.

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

鲜活河蚬：泉州永辉超市（泉秀店），暂养，吐沙清洗后，置于沸水浴中热烫约10 s 至微开壳，取蚬肉，用组织捣碎机捣碎，制得蚬肉泥，备用.

蛋白酶Neutrase（1.5 AU-N/g）、Alcalase（2.4 AU-A/g）、Flavourzyme（500 LAPU/g）：诺维信（中国）生物技术有限公司；葡萄糖（AR）：国药集团化学试剂有限公司.

1.2 仪器与设备

DK-42OS 型三用恒温水箱：上海精宏实验设备有限公司；PHS-3C 微型机pH 计：上海康仪仪器有限公司；TDL-40B 飞鸽离心机：上海康亭科学仪器厂；YXQ-LS-30 SLL 立式压力蒸汽灭菌器：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；L-8900 日立氨基酸分析仪：天美（中国）科学仪器有限公司.

1.3 试验方法

1.3.1 河蚬蛋白酶解液的制备

称取蚬肉泥10 g，加入蒸馏水30 mL，用Neutrase/Alcalase 混合酶在其较优酶解条件（反应温度55 ℃，pH 7.0，加酶量1.5%）下于恒温水箱中酶解2.0 h，冷却至50 ℃，调pH 6.0，添加Flavourzyme（加酶量1.6%）继续水解.3 h 后灭酶（100 ℃，10 min）、在4 000 r/min 下离心10 min，取上清液，制得河蚬蛋白酶解液.

1.3.2 美拉德反应产物制备

量取20 mL 河蚬蛋白酶解液于试管中，加入葡萄糖，放入恒温水箱（反应温度低于100 ℃时）或压力蒸汽灭菌器（反应温度高于100 ℃时），设置一定温度和时间进行热反应.结束后取出，置于冰浴中冷却获得.

1.3.3 单因素试验

美拉德反应产物与糖和氨基酸种类、反应温度、反应时间及环境pH 值等密切相关[10].由于葡萄糖廉价易得，反应性能好，所以本试验选用葡萄糖作为美拉德反应原料.

（1）葡萄糖添加量分别为10%、15%、20%、25%、30%、35%，反应温度100 ℃，反应时间60 min，初始pH 6.5；

（2）反应温度分别为80 ℃、90 ℃、100 ℃、110℃、120 ℃，葡萄糖添加量30%，反应时间60 min，初始pH 6.5；

（3）反应时间分别为20、40、60、80、100 min，葡萄糖添加量30%，反应温度110 ℃，初始pH 6.5；

（4）初始pH 值（用小苏打或柠檬酸调节）分别为4.5、5.5、6.5、7.5、8.5，葡萄糖添加量30%，反应温度110 ℃，反应时间80 min.

1.3.4 二次回归正交旋转组合设计[11]

根据单因素试验结果确定各个因素的水平范围.为保持河蚬天然风味，试验采用河蚬蛋白酶解液的自然pH 6.43 作为美拉德反应的初始pH 值，以葡萄糖添加量（X1）、反应温度（X2）、反应时间（X3）为决策变量，风味评分值为目标函数，各因素水平编码见表1.

表1 因素水平编码

1.4 测定方法

1.4.1 美拉德反应感官风味的评定

气味判定方法：采用闻香纸浸入样品中1～2 cm，然后在离闻香纸2～3 cm 处通过鼻孔吸气，每次2～3 s，根据产品气味打分，最高得分为50.滋味判定方法:准确量取样品10 mL，加80 ℃水10 mL，充分混合后冷却至20～25 ℃后进行品尝，根据产品滋味打分，最高分为50[8].

由10 名感官评定员组成风味评定小组，采用先嗅后尝分别对美拉德反应产物的气味和滋味打分，评分标准见表2，然后将气味和滋味评分值相加即为样品的风味评分值.以10 名感官评定员评分的算术平均值作为最终风味评分值.

表2 风味评分标准

1.4.2 游离氨基酸组成分析

准确称取1 g 样品，加入15 mL 0.1 mol/L 盐酸超声提取20 min，加15 mL 磺基水杨酸（80 g/L）沉淀蛋白，加入少许EDTA 络合金属离子，然后加纯水稀释定容至刻度线，混匀.在16 000 r/min 下离心10 min，取上清液，过0.22 μm 滤膜，参照GB/T 5009.124—2003 上氨基酸分析仪测试.

2 结果与分析

2.1 单因素试验（图1）

2.1.1 葡萄糖添加量的影响

随着葡萄糖添加量的增加，反应产物的褐变程度持续加深.由图1-A 可知，美拉德反应产物的风味评分值在葡萄糖添加量10%～30%之间逐渐升高，在葡萄糖添加量30%时达到最大值，之后风味评分值略有下降，这可能是由于随着反应的进行，美拉德反应产物与添加的葡萄糖继续反应，生成感官不佳的物质，因此确定最佳葡萄糖添加量为30%.

图1 葡萄糖添加量、反应温度、反应时间、初始pH 值对风味评分值的影响

2.1.2 反应温度的影响

美拉德反应受温度的影响很大，温度每相差10 ℃，其褐变速度相差3～5 倍[12]，特别是超过100℃以后，褐变速度明显加快.一般来讲，模式反应温度不能超过180 ℃，温度过高，会产生较强烈的异味；温度过低，反应程度不够，产生的香气同样不够浓郁[13].由图1-B 可知，在80～110 ℃范围内，美拉德反应产物的风味评分值逐渐升高，在反应温度110 ℃时达到最大值，之后风味评分值明显下降，这可能是由于温度过高产生异味所致，因此确定反应温度110 ℃为宜.

2.1.3 反应时间的影响

随着反应时间的延长，氨基酸与还原糖不断反应，褐变程度持续加深.由图1-C 可知，在20～80 min 范围内，美拉德反应产物的风味评分值逐渐升高，在反应时间80 min 时达到最大值，之后风味评分值明显下降，这可能是由于反应末期，除了产物进一步缩合、聚合形成复杂的类黑精物质外，还生成了其他感官不佳的物质，因此确定反应时间80 min 为宜.

2.1.4 初始pH 值的影响

美拉德反应在酸碱环境中均可发生，但在pH值大于3 时，其反应速度随着pH 值的升高而加快[12]，偏碱性的环境有利于美拉德反应的进行.由图1-D 可知，美拉德反应产物的风味评分值在pH值6.5 时最高，此时产生明显的酱香味，之后风味评分值开始下降；在pH 7.5 时，产生麦香气味；而在pH 8.5 时，褐变程度最大，却产生不愉快气味.因此确定初始pH 6.5 最佳，恰与河蚬蛋白酶解液自然pH 6.43 接近.

2.2 热反应条件优化

2.2.1 回归方程的建立与检验

热反应试验方案与结果见表3.采用DPS 数据处理系统[14]对试验结果进行统计分析，建立风味评分值Y 与葡萄糖添加量（X1），反应温度（X2）、反应时间（X3）的数学回归模型，得到回归模型方程.

通过方差分析（表4），可见该模型方程的回归项在α=0.01 水平上显著，失拟项不显著，模型可用.通过回归系数显著性分析（表5），剔除α=0.05显著水平的不显著系数项后，得到简化的回归方程:

另外，表5 的结果还表明，影响风味评分值各因素的主次顺序为：反应温度＞葡萄糖添加量＞反应时间.反应温度和葡萄糖添加量的影响均达到水平显著P＜0.01，反应时间的影响达到水平显著P＜0.05.反应温度和反应时间之间的交互作用显著（P＜0.05），其他因素之间的交互作用不显著.

2.2.2 单因子效应与边际效应分析

将其他因子固定在零水平，描述单个因子变动时对风味评分值的影响，3 个因子的单因子效应方程分别为：

表3 热反应试验方案与结果

表4 方差分析

表5 回归系数显著性分析

根据这些方程，得到单因子效应曲线如图2所示.

图2 单因子效应曲线

由图2 可知，风味评分值随着葡萄糖添加量的增加而逐渐上升；随着反应温度的升高呈先上升后下降趋势；随着反应时间的延长而缓慢上升.

对单因子效应方程求一阶偏导数，得到单因子边际效应方程.单因子的边际效应反映风味评分值随各因素变化的速率.单因子边际效应方程分别为：

对边际效应方程作曲线可得到边际效应曲线如图3 所示.

图3 边际效应曲线

由图3 可以看出，反应温度的斜率绝对值最大，这表明随反应温度的变化，风味评分值的变化速率最快，其次是葡萄糖添加量，最后是反应时间变化速度最慢.

2.2.3 交互效应分析

反应温度与反应时间之间对风味评分值的影响有交互作用（P＜0.05），如图4 所示.由图4 可知，当葡萄糖添加量为零水平时，反应温度X2在小于上水平（114 ℃）的范围内，风味评分值与反应时间X3有正相关交互作用，即随着反应时间的延长，风味评分值逐渐上升；若反应温度X2大于上水平（114 ℃）时，风味评分值与反应时间X3有负相关交互作用，即随着反应时间的延长，风味评分值呈下降趋势.当反应温度为零水平时，葡萄糖添加量与反应时间交互作用不显著；当反应时间为零水平时，葡萄糖添加量与反应温度交互作用也不显著.

图4 风味评分值随X2、X3变化趋势

2.2.4 最优工艺条件的确定

采用DPS 数据处理系统[14]对试验数据进行分析，得出最优热反应条件为：葡萄糖添加量30%，反应温度102 ℃，反应时间80 min，在此条件下风味评分值拟合值为89.3 分.优化后的反应温度接近100 ℃，考虑到实际生产操作与节能，验证试验时采用反应温度100 ℃，在上述最优工艺条件下制备热反应型酱香调味基料，风味评分值达90.1 分.制备获得的调味基料鲜甜适口、酱香味浓.

2.3 热反应前后游离氨基酸组成的变化

根据前面最优热反应条件进行美拉德反应，对产物进行游离氨基酸组成分析，并与热反应前河蚬蛋白酶解液进行比较（表6）.结果表明，热反应后产物中17 种游离氨基酸的含量均有不同程度损失，其中组氨酸、赖氨酸、精氨酸的损失率较大（均超过50%），说明这3 种氨基酸是参与该美拉德反应产生酱香味的主要氨基酸.另外，根据各种氨基酸的呈味特性[15]，发现损失率较大的这3 种氨基酸均为苦味氨基酸，而呈鲜味的天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸和甘氨酸等损失率都较小（均低于35%），这说明该美拉德反应不仅能形成愉快的酱香风味，还能较好地保留原酶解液的鲜味.童彦等[13，16]在研究中也发现类似规律.热反应产物中，必需氨基酸含量占游离氨基酸总量的比例达58.2%，说明作为一种添加剂，它还是一种具有较好营养价值的蛋白源.

3 结论

采用二次回归正交旋转组合设计，建立风味评分值与葡萄糖添加量、反应温度及反应时间的数学回归模型：Y=81.1+1.73X1+2.74X2+1.40X3-1.39X22-2.00X2X3.该回归模型与实际情况拟合，可以用来反映实际生产中各因素对风味评分值的影响规律.

确定河蚬蛋白酶解液制备热反应型酱香调味基料的最优工艺条件为：葡萄糖添加量30%，反应温度100 ℃，反应时间80 min，该条件下风味评分值90.1 分.本试验制备的热反应型酱香调味基料鲜甜适口、酱香味浓.

表6 热反应前后游离氨基酸组成的变化

比较热反应前后17 种游离氨基酸组成的变化情况，发现组氨酸、赖氨酸、精氨酸的损失率较大（均超过50%），说明这3 种氨基酸是参与该美拉德反应产生酱香味的主要氨基酸.热反应产物中，必需氨基酸含量占游离氨基酸总量的比例达58.2%，是一种具有较高营养价值的蛋白源.

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