胰腺腺泡细胞钙振荡及其研究进展

麻晓静，沈建新，秦达念，王海燕

(汕头大学医学院 1生理学教研室， 2病理生理学教研室，广东 汕头 515041)

胰腺腺泡细胞在兴奋剂刺激下产生的规律性钙振荡是指胞质游离钙的周期性升高和恢复，是一种普遍的胞内钙信号形式，几乎在迄今研究过的所有细胞中均可观察到[1]。胰腺腺泡细胞是一种非兴奋性细胞，主要负责分泌胰液。生理情况下，胰腺腺泡细胞的分泌主要受迷走神经末梢释放的乙酰胆碱(acetylcholine，ACh)和小肠黏膜中I细胞分泌的一种多肽激素缩胆囊素(cholecystokinin，CCK)的双重调节。离体研究中发现，ACh和CCK都可作为受体激动剂引起胰腺腺泡细胞产生钙振荡。可见钙振荡与胰腺腺泡细胞的分泌功能密切相关[1-2]。ACh和CCK引起的钙振荡各有特点，这可能与它们的产生机制不同有关。

1 胰腺腺泡细胞

正常情况下，机体中胰腺腺泡细胞在形态结构上有极性，其酶原颗粒集中在细胞顶端形成分泌极；细胞的内质网非常发达，形成一个稠密的相互连通的管状系统，包围着位于细胞基底部的细胞核，并占据了基底区的主要部分，其终端延伸到酶原颗粒区并一路贯穿到顶端细胞膜；高尔基体和线粒体位于细胞核与酶原颗粒区之间(图1，见封三)[3]。离体的单个胰腺腺泡细胞在形态上虽有较大改变，但保留了完整的胞内Ca2+信号系统，是研究Ca2+信号的常用模型[4]。

2 胰腺腺泡细胞钙振荡

2.1胰腺腺泡细胞钙振荡的特征 神经递质ACh和激素CCK可引起特征不同的钙振荡模式[5]。低浓度(生理浓度，25～500 nmol)ACh可引起高频(0.050～0.133 Hz)正弦波钙振荡，一般开始于细胞的分泌极，并传播到整个细胞；低浓度(生理浓度，1～50 pmol)CCK可引起低频(<0.017 Hz)的持续时间较长的一系列离散的钙瞬变。在钙瞬变过程中，胞内Ca2+浓度的升高和恢复比较慢，并且几乎同时遍及整个细胞[5-6]。由ACh引起的高频钙振荡具有细胞外Ca2+的依赖性，在排除细胞外Ca2+后振荡逐渐消失；而CCK引起的低频钙瞬变对细胞外Ca2+的依赖性较小，故在缺乏胞外Ca2+时仍能持续[6]。ACh在特殊条件下也能引起类似于CCK引起的低频钙瞬变[6]。另外，CCK能显著增强ACh引起的反应，把局部高频钙振荡变成持续时间较长的整体钙瞬变，这个现象依赖于环ADP核糖受体的激活[2,7-8]。

在胰腺腺泡细胞中，不同浓度的CCK也可引起波形有所不同的钙振荡。低浓度(≤5 pmol)CCK可引起局部短时持续钙峰，而稍高浓度(10～20 pmol)CCK可引起短时持续钙峰和较宽钙瞬变的混合波[5]。10 pmol的CCK可引起规律性钙振荡，CCK受体拮抗剂FK480(10 nmol)能完全阻断这种振荡，并且这种抑制作用能持续相当长的时间[9]。用20 pmol的CCK刺激腺泡细胞，无论是否存在胞外Ca2+，都可引起钙振荡[10-11]。

2.2胰腺腺泡细胞钙振荡的测定方法

2.2.1直接法 直接法即钙荧光指示剂法，钙荧光指示剂与胞内游离钙离子结合后，用相应波长的激发光可使其发出特定波长的荧光。

Fura-2是典型的双波长荧光指示剂，其本身的激发波长为380 nm；与游离Ca2+结合后形成Fura-2-Ca2+复合物，激发波长为340 nm；发射荧光波长均约为510 nm。因此，Fura-2与游离Ca2+结合后，380 nm处荧光减弱，而340 nm处荧光增强。通过荧光比值(F340/F380)变化的Ca2+依赖性可定量测定胞内游离Ca2+浓度[12]。

Fluo-3是典型的单波长指示剂，其最大吸收波峰为506 nm，最大发射波长为526 nm，可在远离340～380 nm波长范围(属紫外光)内被可见激光(488nm)激发而测得钙荧光。Fluo-3结合Ca2+后的荧光强度比游离态的高出35～40倍，可有效避免透镜吸收和细胞自身的荧光干扰。Fluo-3对Ca2+的特异性强，亲和力弱，易解离，适合测定胞内Ca2+的快速、微量变化，常与激光共聚焦显微镜或双光子显微镜联用，以测定胞内Ca2+的动态变化。

Fluo-4是将Fluo-3结构中的Cl替换成F的钙荧光指示剂，由于F的电子吸引力更强，其最大激发波长为494nm，这与氩激光的激发波长(488 nm)更接近，故其激发荧光强度可比Fluo-3强一倍[12-13]。

钙荧光强度的变化可用荧光显微镜、激光共聚焦扫描显微镜、双光子显微镜等仪器检测，从而定量研究胰腺腺泡钙振荡。直接法可受指示剂区域化、荧光衰减或光漂白、酯不完全水解、猝灭剂的干扰，以及细胞毒、细胞自身荧光干扰等因素的影响，测定时需加以注意并按需要选择[12-13]。

2.2.2间接法 间接法即通过全细胞膜片钳法记录胞内钙激活的氯离子流变化。经典的做法是在全细胞膜片钳模式下将膜电位钳制在-30 mV，往胞外液中加入胰腺腺泡细胞的受体激动剂ACh或CCK，此时所记录到的全细胞电流主要为胞质Ca2+浓度变化所激活的氯离子通道电流，可间接但实时地反映激动剂ACh或CCK所引起的胰腺腺泡细胞钙振荡(图2)[14]。

A和C是采用荧光成像法(fura-2)记录的分别由ACh(A)和CCK(C)引起的胰腺腺泡细胞钙振荡，B和D是采用全细胞膜片钳法记录的分别由ACh(B)和CCK(D)引起的胰腺腺泡细胞钙振荡

图2不同测定方法记录的胰腺腺泡细胞钙振荡

2.3胰腺腺泡细胞钙振荡的发生机制 从20世纪90年代至今，针对不同的细胞种类和兴奋剂，人们从不同的角度提出了多种钙振荡模型，大致可概括为以下两类[1]：①基于三磷酸肌醇(inositol-1,4,5-trisphosphate,IP3)代谢的模型，该模型假设胞质IP3浓度的周期性波动引起钙振荡；②基于各种通道功能活动的模型，按涉及的通道不同又可分成三类：细胞膜电压门控Ca2+通道依赖型、兰尼碱受体依赖型和IP3受体依赖型。由于能影响钙振荡的因素多种多样，目前尚未能找到一种理想的模型可以囊括已有的主要研究成果并对钙振荡的确切机制做出可检验的多种预测。

在胰腺腺泡细胞中，IP3受体和兰尼碱受体之间的相互作用有非常重要的生理学意义[1]。由ACh和CCK刺激引起的Ca2+振荡也总是依赖于这两种受体[2,15]。研究表明，CCK结合胞膜上的CCK1受体，而ACh结合胞膜上的M3受体(一种毒蕈碱型乙酰胆碱受体)[7]。CCK与CCK1受体结合后以某种方式激活ADP核糖环化酶，进而形成两种信号信使：烟酸腺苷二磷酸和环ADP核糖。这两种信号信使可轮流激活胞内钙库(即内质网)上的兰尼碱受体，从而释放Ca2+，胞内Ca2+水平因而升高。ACh则通过经典的G蛋白(一种由α、β和γ三亚基组成的三聚体蛋白)通路来激活磷脂酶C，进而形成IP3和二酰甘油，IP3再激活胞内钙库上的IP3受体，从而释放Ca2+[7]。另外，胆汁酸(如牛磺石胆酸)也可通过胞膜上的Gpbar1受体遵循与ACh类似的信号转导通路使胞内IP3增多，从而升高胞内Ca2+水平[2]。钙库释放的钙又可遵循钙诱导钙释放的机制使钙库内的钙不断减少，钙库内钙量减少的信息可被钙库膜上的感受蛋白间质相互作用分子1(stromal interaction molecule 1，STIM1)所感知，之后STIM1可因此转位到细胞膜上与膜上的钙库储量依赖性钙通道的亚基Orai结合，这样胞外钙可循此通道流入胞内，并进入钙库中使钙库再次充盈[2,7]。胞内持续升高的Ca2+可被细胞膜上的钙泵移出胞外或被钙库膜上的钙泵重吸收回钙库中[2]。胞内的线粒体在一定钙水平的作用下则可通过氧化还原反应产生足够的能量(ATP)以满足主动转运钙的需要[2]。上述有关过程可能以目前尚未完全明确的方式交叉进行，循环往复，从而形成胰腺腺泡细胞中规律性的振荡(图3)[2,7]。

ADP-ribosyl cyclase：ADP核糖环化酶;NAADP：烟酰胺腺苷二磷酸;cADPR：环ADP核糖;RyR：兰尼碱受体;PLC:磷脂酶C;IP3：三磷酸肌醇;IP3R：三磷酸肌醇受体；TLC-S：牛磺石胆酸；SOC channels：钙库储量依赖性钙通道；PMCA：细胞膜上的钙泵；SERCA：钙库膜上的钙泵；Plasma Membrane：细胞膜，ER：内质网；Mitochondrion：线粒体

图3CCK和ACh引起胰腺腺泡细胞钙振荡的不同机制示意图[2,7]

与可兴奋细胞相比，胰腺腺泡细胞的跨膜化学和生物物理参数不太容易监控，所以要完全明确钙振荡发生的机制仍有许多困难。因此，尽管钙振荡的机制已经被广泛地研究了20多年，但钙振荡产生的确切机制仍存在不少争议[1]。

2.4胰腺腺泡细胞钙振荡的生理和“病理生理学”意义 生理情况下，不管是ACh还是CCK，都是通过引起胞内产生钙振荡的方式来引起腺泡细胞分泌胰酶的。胞质游离Ca2+作为胞内第二信使，其浓度的周期性涨落必然引起它所介导的生物效应，如分泌等过程呈周期性起伏。钙振荡过程中，Ca2+浓度的起伏波动既能有效地触发相应的生理效应，同时又能防止胞内Ca2+浓度长时间过度升高，以免损伤细胞自身，并维护了细胞对刺激的反应性[16]。

ACh和CCK通过引起细胞顶端局部的胞质钙振荡来控制细胞分泌[17]。在正常的分泌活动中，胰腺腺泡细胞中规律性的钙振荡通常只局限于分泌极[18-19]；而某些过度刺激因素如高浓度的乙醇代谢产物则可引起持续的全细胞Ca2+浓度升高，由此可引起异常的酶原激活、空泡形成以及细胞坏死，出现急性胰腺炎症状[2,20-21]。胰腺是人体的一个重要的分泌器官，胞内Ca2+在胰腺刺激-分泌耦联中的重要性已被公认，但对于腺泡细胞分泌与其钙振荡之间的确切关系还需更深入的研究。

3 小 结

综上所述，胰腺腺泡细胞的钙振荡与腺泡细胞的分泌功能密切相关，这类钙振荡不仅反映了正常胰腺腺泡细胞的功能，异常钙振荡可能还是某些胰腺疾病的产生机制(如急性胰腺炎)。因此，研究胞内钙振荡的产生机制和调控具有重要的生理和病理生理学意义。到目前为止，人们采用直接法和间接法对钙振荡的特征和变化规律进行了广泛的研究，已经有了很多认识，但其确切的机制仍需进一步阐明。把共聚焦/双光子成像和多道膜片钳技术结合起来，对钙振荡相关的多种指标(包括钙信号，细胞的不同区域、不同通道和受体的功能状态，以及某些胞内特殊成分的功能改变等信息)进行同步实时的监测和比较分析(目前还未见有这样做的研究结果出现，但这样做的技术条件已经成熟)，对于更深入探讨胰腺腺泡细胞钙振荡的发生机制将会有重要意义。

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