老年肺结核患者外周血NKG2A、NKG2D表达及相关分析

魏 兰,李 辉

结核病是威胁人类健康的重要传染病之一,其发病率及死亡高峰逐渐移向老年人[1]。结核病中以肺结核最为多见。近年来研究发现,肺结核的发病和转归与机体的免疫状态相关,主要是细胞免疫功能。自然杀伤细胞(natural killer,NK)是细胞免疫系统的第一道防线,而NK细胞的有效活化依赖其活化和抑制信号之间的动态平衡。NKG2A、NKG2D分别是NK细胞表面主要的抑制性受体和活化性受体之一,正常情况下,两种受体表达趋于平衡。本研究将NKG2A、NKG2D表达水平的变化作为检测指标,旨在探讨NKG2A、NKG2D表达水平变化对老年肺结核患者免疫功能状态的影响,并为肺结核免疫治疗提供新思路和理论依据。

1 对象与方法

1.1研究对象 共入选初治肺结核100例,其中男53例,女47例,年龄60～81岁,平均70.5岁。病例来源于我院2012年5月～2013年5月的住院患者,未经抗痨治疗或治疗未超过1月,以防止治疗对结果的干扰。根据痰检结果分为:(1)初治菌阴肺结核组:55例,符合中华医学会结核病学会制定的《肺结核诊断和指南》中“菌阴肺结核诊断”[2]标准；(2)初治菌阳肺结核组:45例,符合国家传染肺结核诊断标准。根据是否合并肺外结核分为:(1)无肺外结核组:48例；(2)合并肺外结核组:52例(其中淋巴结核20例,结核性胸腔积液15例,胸壁结核10例,结核性腹腔积液7例)。根据肺部病灶受累程度分为:1～2个肺野组46例,3～4个肺野组40例,5～6个肺野组14例。根据有无空洞分为有空洞组(52例)及无空洞组(48例)。以同期我院健康体检者89名为对照,男49名,女40名；年龄60～85岁,平均72.5岁。

1.2试剂与仪器 NKG2A-PE、NKG2D-PE(R&D公司),CD3- PE-Cy5、CD56-FITC试剂盒(eBioscience公司),PBS稀释液、牛血清白蛋白、淋巴细胞分离液(海澳生物工程公司)；FACS Calibur 型流式细胞仪(美国BD公司)。

1.3方法 抽取所有对象清晨空腹上肢静脉血2 ml,EDTA抗凝,6 h内处理,并将抗凝血2 ml与等体积的PBS缓冲液混匀,缓慢注入淋巴细胞分离液液面之上,分离单个核细胞,PBS洗涤,将细胞悬液1200 r/min离心5 min,弃上清,用 PBS 100 μl重悬细胞。检测NKG2A时,管中加入CD56-FITC、NKG2A-PE和CD3-PE-Cy5各10 μl；检测NKG2D时,管中加入CD56-FITC、NKG2D-PE和CD3-PE-Cy5各10 μl,4 ℃孵育30 min,同时设阴性对照。1000 r/min离心10 min,弃上清,PBS冲洗2次,除去未结合的抗体。转移至流式管,加入适量PBS缓冲液待测。用流式细胞仪测定NK细胞表面受体。实验结果用Expo 32 ADC软件进行分析,得到荧光标记阳性细胞的百分数。

2 结果

结核组与体检组相比,外周血NK细胞表面受体NKG2D表达明显降低,NKG2A的表达明显上调(P<0.05,表1)。

表1 结核组与体检组NKG2A与NKG2D表达率的差异(%)

单纯肺结核组与肺结核合并肺外结核组相比,肺结核合并肺外结核的NKG2A表达增高(P<0.05)。根据肺部病灶受累程度分为:1～2个肺野组、3～4个肺野组、5～6个肺野组。结果显示,各组间NKG2D表达率差异有统计学意义(P<0.05),NKG2D表达随着病灶受累范围增加而降低。菌阴肺结核组与菌阳肺结核组、空洞组与无空洞组相比,NKG2D、 NKG2A表达均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 老年初治肺结核患者不同组别NKG2A与NKG2D表达率的变化(%)

3 讨论

NK细胞既是重要的自然防御细胞,又是体内多种免疫细胞尤其是T淋巴细胞的调节细胞。肺结核患者NK细胞活性降低早有报道,如Yildiz等[3]、Leung等[4]均报道肺结核患者与健康人对比,NK细胞显著下降。翟慧等[5]报道,肺结核患者与非肺结核患者相比,NK细胞明显降低。NK细胞的功能状态主要由其表面活化性受体(NKG2D)及抑制性受体(NKG2A)的平衡状态决定。二者特异性识别相应配体,分别转导活化或抑制信号,协同作用调节NK细胞活性。因NK细胞表达CD56,不表达CD3,而NKT细胞同时表达CD3和CD56两种膜蛋白分子,本研究为避免NKT细胞的干扰,将分析区域设定为CD56+CD3-的细胞群设门(即对细胞群进行分析)。

结核组与体检组相比,外周血NK细胞表面活化性受体NKG2D表达下降,而抑制性受体NKG2A表达上调,提示NK细胞杀伤活性受到抑制。李军等[6]研究显示,在结核杆菌耐热抗原的刺激下,第12 d出现NK细胞及T细胞表面NKG2A表达量升高,与本研究结果一致；NKG2D无显著变化,与本研究结果不相符。同时已有研究表明,在结核杆菌耐热抗原刺激初期12 h之后,NK细胞活化,进一步刺激γδT细胞增殖[7]。而增殖的γδT细胞对结核杆菌有很强的杀伤作用,这种作用依赖于NK细胞的活化[8]。

结核菌侵入机体后,机体抵抗力较强时,不发生肺结核或仅为隐性感染,但结核菌仍在体内存活、繁殖,并播散至其他部位。机体免疫力降低时,转变为显性感染,形成相应部位的结核,即肺外结核。本研究结果表明,合并肺外结核组与单纯肺结核组相比,外周血NK细胞表面抑制性受体(NKG2A)表达量升高,活化性受体无明显变化,提示合并肺外结核患者NK细胞杀伤活性明显降低,机体免疫功能降低。付笑迎等[9]研究显示,与健康人外周血NK细胞相比,结核性胸腔积液中的NK细胞降低,NKG2D和NKG2A表达均明显增加。提示在结核局部免疫状态中,NK细胞处于活化状态,发挥其杀伤作用。NK细胞受体表达在局部免疫状态与全身免疫状态的不同,有待于进一步研究。

本研究根据肺结核患者肺部病灶受累程度分为1～2个肺野组、3～4个肺野组、5～6个肺野组。结果显示,NKG2D表达率在3组间有统计学差异,且随着病变累及范围的增加而降低。而NKG2D作为活化性受体,其表达率降低可减弱NK细胞对病原菌的杀伤作用,使结核杆菌更易发生免疫逃逸,从而进一步加重病情,与翟慧等[5]研究结果相一致。

本研究发现,菌阳肺结核与菌阴肺结核、肺结核空洞组与无空洞组相比,NKG2A、NKG2D表达差异无统计学意义。目前国内外尚无相关报道,此观点有待今后研究进一步探讨。

综上所述,随着老年肺结核患者病情进展,机体免疫功能降低,陷入恶性循环。检测老年肺结核患者外周血NKG2A、NKG2D的表达变化,对了解患者机体免疫功能的状态、病情估计有一定临床价值,可为免疫治疗提供重要的理论依据。

【参考文献】

[1] 肖和平.要重视老年肺结核[J].中华结核和呼吸杂志,2000,23(12):709-710.

[2] 中华医学会结核学分会.肺结核诊断及治疗指南[J].中华结核和呼吸杂志,2001,24(2):71-74.

[3] Yildiz P,Kadakai F.Natural killer cell activity in multidrug resistant pulmonary tuberculosis[J].Respiration,2001,68(6):590-594.

[4] Leung WL,Law KL,Leung VS,et al.Comparison of intracellular cytokine flow cytometry and an enzyme immunoassay for evaluation of cellular immune response to active tuberculosis[J].Clin Vaccine Immunol,2009,16(3):344-351.

[5] 翟慧,刘一典,唐神结,等.肺结核患者外周血NKT细胞、NK细胞、T淋巴细胞亚群的变化及意义[J].同济大学学报,2010,31(5):42-46.

[6] 李军,魏海明,张瑞军,等.结核杆菌耐热抗原对人外周血淋巴细胞NKG2A、NKG2D的影响[J].中国免疫学杂志,2005,21(8):571-574.

[7] Rui-Jun Zhang,Hai-Ming Wei,Bai-Qing Li,et al.Human natural killer cells positively regulate γδT cells in response toMycobacteriumtuberculosis[J].Faseb J,2003,17(7)：C308.

[8] 高学平,宋秀宇,陈勇,等.结核杆菌低分子多肽抗原诱导活化的γδT细胞的细胞毒活性研究[J].细胞与分子免疫学杂志,2000,16(5):391-393.

[9] 付笑迎,李丽,李琴,等.胸液中NK 细胞的亚群及表型功能特征分析[J].免疫学杂志,2012,28(8):691-694.