两种取材方法体外培养结膜细胞的实验比较

陈 康,蔡晓峰,李旭清,秦 驰,庹 瑶,赖 佳

翼状胬肉是眼表常见疾病,目前结膜移植是有效降低翼状胬肉复发的手术方式,但是结膜移植的供区切取面积较大时,结膜不能完全拉拢缝合,存在出现慢性肉芽肿的可能,且较大面积的结膜取材可能导致供区结膜瘢痕化,因此,如何能减少结膜供区损伤是目前需要解决的问题。近来有研究提出,通过组织块培养法进行自体结膜细胞培养后再回植可供参考。但组织块培养法要手术切取患者结膜组织,部分患者依从性不好。而患者对于结膜刮片的接受度较高,我们探索能否不切取组织块,单纯通过结膜细胞刮片法培养自体结膜上皮细胞,本研究拟比较两种不同取材方法结膜细胞培养的差异。

1 材料与方法

1.1材料 收集我院眼科门诊2010～2013年原发性翼状胬肉患者10例(10眼),男性7例,女性3例,年龄34～62(47.3±15.8)岁；病史3～12(6.5±4.1)年。排除血液系统疾病、结缔组织病、瘢痕体质、活动期传染病、角膜缘干细胞缺乏、结膜广泛瘢痕、泪液分泌功能不良及手术区域外伤手术史患者。所有患者均为原发性翼状胬肉,诊断标准:显微血管组织侵入角膜超过1 mm。翼状胬肉范围3～5钟点位,伸入角膜2～4(3.2±0.9)mm,翼状胬肉分级Ⅱ～Ⅲ级。根据赫尔辛基宣言,本研究经医院伦理委员会同意,所有患者签署知情同意书。所有手术及取材均由同一主治医师操作。

1.2试剂和设备 DMEM/F12组织培养液(Sigma公司),胎牛血清(Sigma公司),一抗:鼠抗人单克隆抗体PCNA、CK13(Sant公司),二抗:荧光标记山羊抗鼠抗体(Sant公司),荧光显微镜(奥林巴斯 BX51),手术显微镜(拓扑康800型),恒温孵箱(福意FYL-YS),显微手术器械(苏州六六医疗器械公司)。

1.3标本取材

1.3.1结膜上皮组织块切取 患者麻醉满意、翼状胬肉病灶切除后,切取颞下方近角膜缘正常结膜组织,大小2 mm×2 mm,修剪结膜下结缔组织,置于DMEM/F12组织培养液的EP管中。按照翼状胬肉缺损大小,另取相应的结膜移植物,常规进行结膜游离移植。

1.3.2结膜上皮细胞刮片 翼状胬肉切除手术过程同上,切取细胞培养的结膜上皮组织块和游离移植的结膜组织后,在下方接近穹窿部,用小圆刀片斜向刮取结膜上皮细胞,一般需要刮取3～5次,以结膜表面微渗血为度,虹膜恢复器将刮取组织转入DMEM/F12组织培养液的EP管中。

1.4结膜细胞培养方法

1.4.1结膜上皮组织块 将结膜上皮组织块上皮面朝瓶壁,加入10%胎牛血清的DMEM/F12培养液放CO2恒温孵箱培养,待细胞爬壁后去除组织块,将取下的爬壁结膜上皮细胞离心,常规培养及鉴定[1-2],按照1∶2比例传代。

1.4.2结膜上皮细胞刮片 将EP管常规离心,去上清,DMEM/F12组织培养液吹打成细胞悬液后,直接转入含10%胎牛血清、DMEM/F12培养液的培养瓶中,放CO2恒温孵箱培养,细胞爬满瓶壁后,常规离心、传代、鉴定。

1.5观察指标 共聚焦显微镜下观察结膜上皮细胞生长情况；传代到第4代后,进行结膜细胞CK、PCNA荧光标记,观察细胞荧光标记结果。

2 结果

2.1细胞培养生长情况 组织块培养法,细胞1～3 d贴壁,细胞呈多角形或纺锤形,胞体梭长；5～7 d铺满瓶底,排列紧密,细胞呈椭圆形或圆锥形；传代3～4代细胞外形无明显变化。刮片培养法,获得细胞较少,一般1～3 d贴壁,贴壁效率较低,死亡率较高,细胞形态同组织块培养法,呈多角形或纺锤形,胞体梭长；铺满瓶底时间较长,需要14～20 d,细胞排列紧密,呈椭圆形或圆锥形；传代3～4代细胞外形无明显变化。见图1。

2.2细胞鉴定 两组细胞采用双标,分别用TRITC标记CK和FITC标记PCNA,均呈阳性,见图2-3。

图1 结膜组织块培养法结膜上皮细胞生长情况

图2 组织块培养法荧光标记结果

图3 细胞刮片培养法荧光标记结果

3 讨论

翼状胬肉的手术方法不断改进,其主要目的是降低术后的复发率。目前主流的方法是结膜移植、角膜缘干细胞移植和角膜缘干细胞联合结膜移植,使翼状胬肉的复发率由原来的20%～70%,降到现在的3%～8%,结合局部运用丝裂霉素、注射雷珠单抗、可吸收生物材料粘合剂等,复发率进一步降低[3-5]。

细胞角蛋白(cytokeratin,CK)可以识别绝大部分酸性细胞角蛋白(Ⅰ型)和碱性细胞角蛋白(Ⅱ型),用于标记上皮及上皮来源的细胞[6-8]。增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)由Miyachi等于1978年在系统性红斑狼疮(SLE)患者的血清中首次发现并命名,因其只存在于正常增殖细胞及肿瘤细胞内而得名。PCNA与细胞DNA合成关系密切,在细胞增殖的启动上起重要作用,是反映细胞增殖状态的良好指标[9-12]。关于结膜细胞的鉴定和评价文献存在争议,本实验是为后续研究做准备,要求细胞是结膜细胞而且活性良好,所以选择CK和PCNA为鉴定指标,CK说明细胞来源是上皮组织,PCNA反映细胞增殖活性。本实验结果表明,两种方法培养的细胞的CK和PCNA荧光标记均呈强阳性,说明为结膜上皮来源的细胞,且活性很好。

根据实验体会,组织块培养法组织块要尽量剪小,约1 mm×1 mm,培养液尽量少,刚覆盖组织块为度,以免组织块漂浮贴壁不良；早期4～6 h对于细胞生长非常关键,我们会重新换液1次；修剪组织块时,剪刀要尽量锋利,避免损伤切面,不利于细胞爬行；后续实验将细胞用于自体回植,所以,从伦理学考虑,选用无血清培养液。刮片法细胞贴壁效率较低,用酶消化后,细胞分离,相对提高了贴壁的效率。

两种方法培养的细胞PCNA相似,无明显差异。但是,组织块法细胞生长快,技术比较稳定。虽然结膜取组织块,但是取材组织较小,对患者影响不大；细胞刮片法虽损伤较小,但是细胞贴壁时间长,部分患者刮片效率较低,甚至存在培养失败的情况。两种方法比较,建议以小组织块法较合理。

综上所述,本实验探讨了两种不同取材方法的差异,从技术的稳定性和细胞培养效率评价,建议采用组织块培养法。

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