高迁移率族蛋白1在脓毒症中作用研究进展

尹晓晗，栾正刚

中国医科大学附属第一医院重症医学科，辽宁 沈阳 110001

脓毒症是感染与创伤后的严重并发症，有极高的病死率[1]。在美国，每年约有750 000人发生脓毒症[2]。单核/巨噬细胞、中性粒细胞等释放的促炎细胞因子是导致脓毒症不良预后的重要因素。促炎细胞因子可引起组织损伤、代谢性酸中毒、低血压、多器官功能障碍，甚至死亡。在注射脂多糖(LPS)构建的大鼠和人类脓毒症模型中，血清TNF-α和IL-1β在1～2 h内迅速上升。大规模临床试验证实，延期给予针对这些早期致炎介质的治疗效果不佳[3]。高迁移率族蛋白1(HMGB1)是一种晚期炎症介质，给予脓毒症患者针对HMGB1的靶向治疗是一种理想的治疗方法。研究发现，即使在LPS注射2 h后给予HMGB1抗体治疗仍能显著降低病死率[4]。HMGB1在炎性疾病，尤其是脓毒症中发挥的作用越来越受到重视。本文就HMGB1的结构、在细胞核内发挥的作用、释放过程和其在炎症反应及脓毒症中发挥的作用研究进展作一综述。

1 HMGB1的发现和结构

HMG(the high-mobility group)因其在聚丙烯酰胺凝胶电泳时快速迁移而命名，分为HMGB、HMGN和HMGA三个家族。其中HMGB家族具有特异性的DNA结合蛋白，包括HMGB1、 HMGB2、 HMGB3和SP100HMG，它们的氨基酸序列高度保守。HMGB1被发现于1978年，它是一种非组蛋白核蛋白，可以改变DNA螺旋结构[5]。此后，有研究将HMGB1作为一种肝素结合蛋白从成神经瘤细胞中分离出来，并发现它对大鼠轴突生长有促进作用[6]。

人类HMGB1基因位于13q12染色体，具有6个多形位点。HMGB1的结构在不同物种的真核细胞中高度保守，人类和啮齿类动物的氨基酸序列具有99%同源性。HMGB1由214个氨基酸组成，翻译后经磷酸化、甲基化、乙酰化等修饰后发挥生物学活性。HMGB1具有一个由185个氨基酸构成的高度极化的结构，碱性一端由具有同源性的A盒和B盒构成HMG盒，酸性一端由带负电荷的天冬门氨酸和谷氨酸构成C末端。A盒和B盒各自由75～80个氨基酸组成，形成两短一长的螺旋结构，折叠后形成L形或V形三级结构。HMGB1有两个分别由氨基酸24～43和178～184构成的正电荷元件作为核定位信号，而C末端的氨基酸150～183与晚期糖基化终末产物受体(the receptor for advanced glycation end products,RAGE)结合[7]。HMGB1有不成对的半胱氨酸，因此可以与其他蛋白相互作用。

2 HMGB1在细胞核内的作用

HMGB1广泛存在于所有哺乳动物的细胞核中，不同物种之间氨基酸序列高度保守。它在胸腺中大量表达，并粘合在双链DNA沟槽，尤其是弯曲部分。除了与DNA结合，细胞内HMGB1还发挥稳定核小体结构、促进DNA折叠、增强转录、复制和修复等作用。HMGB1在染色质重塑过程中可能持续或短暂地与核小体相互作用。HMGB1的乙酰化和磷酸化过程决定它与其他核蛋白的作用活性，并且为DNA修复过程中所必需。

HMGB1在DNA与转录因子如p53、同源核蛋白质、类固醇激素受体、糖皮质激素受体、RAG1/2(recombination-activating gene 1/2)蛋白的接触过程中起到重要作用。HMGB1基因缺失的小鼠出生后，24 h内死于低血糖[8]。HMGB1缺失的细胞系可以正常生长，但糖皮质激素受体基因表达受损[8]。HMGB1并非所有细胞核内染色质构成所必需，但对某些转录因子的正确转录调控起到关键作用。

3 HMGB1的释放

HMGB1持续表达于静息细胞并储存在细胞核，它的两个赖氨酸富集区使其定位于核内。HMGB1只有释放至细胞外才发挥促炎作用。脓毒症患者HMGB1水平显著上升。在健康动物及正常人类的血浆中，HMGB1的水平低于5 ng/mL，而脓毒症患者中，生存组和死亡组HMGB1水平分别为25.2和83.7 ng/mL[9]。有研究表明，给予内毒素或其他促炎细胞因子如TNF-α、IL-1β或IFN-γ，HMGB1在8 h后从激活的单核/巨噬细胞中释放，并在18～24 h达到峰值[10]。因此，HMGB1在脓毒症治疗过程中具有重要的临床意义，但其释放的机制尚不十分明确，目前已知的机制分为主动释放和被动释放途径。

3.1 HMGB1的主动释放 HMGB1缺乏前导肽，不能直接穿过内质网和高尔基体，但激活的单核/巨噬细胞可以释放大量HMGB1至细胞外。研究表明，HMGB1的释放需要至少三个步骤：从细胞核释放至细胞质、从细胞质转移至细胞器、胞吐作用[11]。被内毒素和多种促炎细胞因子激活后，单核/巨噬细胞通过乙酰化作用，使核内HMGB1移至胞质小泡，继而释放至细胞外[12]。

LPS和TNF-α促使HMGB1释放的途径则不同。LPS经CD14和TNF依赖途径、IFN-β调节的JAK/STAT途径，激活巨噬细胞，后者乙酰化后释放HMGB1到细胞质。另外一些研究发现，LPS还可通过经典蛋白激酶C (the classical protein kinase C,cPKC)途径磷酸化HMGB1，使单核/巨噬细胞通过钙信号调节其释放[13]。TNF-α则是通过磷酸化作用调控HMGB1的释放[14]。

单核/巨噬细胞激活后，在早期16 h，先形成HMGB1的细胞池，之后通过增强胞内HMGB1的生成促使HMGB1向细胞外分泌。与早期炎症介质TNF-α和IL-1β相比，血清中HMGB1水平的上升发生较晚。

研究发现，不仅活化的单核/巨噬细胞可以释放HMGB1，NK细胞、树突状细胞、内皮细胞、神经元细胞、平滑肌细胞、破骨细胞和肠内皮细胞也可分泌HMGB1[15]。垂体细胞经TNF-α和IL-1激活、内皮细胞经促炎细胞因子刺激、肝细胞在缺氧状态都可以释放HMGB1，这些途径可能与钙信号改变相关。

3.2 HMGB1的被动释放 凋亡细胞可以被动释放HMGB1，加重和延迟炎症反应发生。在有丝分裂期和分裂间期，HMGB1与染色质结合松散，当细胞膜完整性被破坏时，HMGB1迅速释放至胞质。HMGB1基因敲除小鼠的坏死细胞促炎能力明显下降，这证明HMGB1具有调节炎症反应的作用[16]。相反，凋亡细胞在继发性坏死和部分自溶时并不释放HMGB1，即使不被吞噬细胞清除也不会促发炎症反应。在凋亡细胞中，由于HMGB1未经乙酰化，与染色质结合紧密，不会释放至细胞外。但最近研究发现，某些类型的凋亡细胞可以在凋亡晚期被动释放HMGB1[17]。Wang等[18]发现，严重脓毒症的小鼠模型中，凋亡细胞通过刺激巨噬细胞释放HMGB1，当脾切除后，血清HMGB1水平降低，病死率降低。

4 HMGB1的受体

HMGB1主要有以下几种信号受体：晚期糖基化终末产物受体(RAGE)、Toll样受体(Toll-like receptor)、多配体蛋白聚糖。HMGB1的不同区域与不同的受体结合而发挥作用。

RAGE是免疫球蛋白超家族的一员，广泛表达于各种细胞，包括单核细胞、平滑肌细胞、内皮细胞和神经元。研究发现，在肿瘤细胞和神经轴突中，RAGE为HMGB1的受体[19]。HMGB1-RAGE配体受体结合后，促进神经轴突增殖和生长，并通过丝裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase,MAPK)、核转录因子NF-κB、纤维蛋白溶解酶原活化、鸟苷三磷酸酶、Rac/Cdc42途径活化细胞内信号。HMGB1可以促进树突细胞成熟，当给予抗-RAGE抗体时，树突细胞的成熟受阻，这说明RAGE是树突细胞成熟和分化过程中的一个相关受体。Liu等[20]证实，在巨噬细胞中，HMGB1上调RAGE表达，并通过RAGE途径诱导细胞凋亡。除了RAGE受体，可能还存在其他受体与HMGB1信号传导相关，当给予可溶性RAGE或RAGE阻断抗体，仅部分减缓HMGB1在胞内的促炎反应。

Park等[21]通过荧光共振能量迁移 (fluorescene resonance energy transfer,FRET)和免疫沉淀法发现，HMGB1在细胞表面与TLR2、TLR4和RAGE相互作用。FRET图像发现，在巨噬细胞RAW264.7，HMGB1与TLR2、TLR4相互作用，而不与RAGE作用。瞬间转染人胚肾293细胞显示，HMGB1通过TLR2、TLR4途径激活细胞。这些研究直接证实，HMGB1与TLR2 和 TLR4 共同作用，产生与LPS导致的相似的细胞内活化和炎症反应。但HMGB1与TLR2、TLR4作用的具体过程仍需进一步研究。除了TLR2和TLR4，TLR9也参与HMGB1-DNA信号传导通路[22]，它的活化依赖HMGB1-DNA复合体而不是单独的HMGB1。

此外，HMGB1通过A盒、B盒或酸性尾巴，与多种蛋白质，如转录因子、类固醇受体、基质金属蛋白酶2和9、病毒结构、纤维蛋白溶酶原活化作用系统中的元件等相互作用。噬菌体展示技术发现，HMGB1有多种不同的肽序列，这也提示HMGB1可以与多种蛋白质相互作用。

5 HMGB1在炎症反应中的作用

HMGB1是一种DNA结合蛋白，作为一种辅助因子在转录调节和基因表达中发挥作用。研究表明，细胞外的HMGB1参与多种病理生理过程，包括糖尿病、抗菌活性、平滑肌细胞的趋化作用、细胞分化、心肌再生、血管生发、组织修复和肿瘤。此外，HMGB1还是一种强效的促炎因子，与多种炎症反应尤其是脓毒症相关。

5.1 体外研究进展 最近研究发现，HMGB1从活化的单核/巨噬细胞中释放，参与内毒素的致病过程、活化巨噬细胞、刺激促炎因子释放。内毒素血症动物及脓毒症患者血清中，原始单核细胞释放的HMGB1可以上调TNF-α mRNA和蛋白质的表达，这种调节呈剂量依赖性，与LPS诱导的TNF-α释放相比，HMGB1的诱导相对延迟且呈双向性。

体外实验还发现，经促炎因子刺激，HMGB1从中性粒细胞释放，诱导炎症介质如IL-1β、TNF-α和IL-8的产生[23]。外源性HMGB1可以诱导内皮细胞释放炎症趋化因子和细胞因子，上调黏附因子表达，继而促进白细胞黏附和迁移，加重炎症反应。HMGB1还可以促使树突细胞成熟和Th1激活，促进树突细胞分泌IL-12及异体T细胞分泌IL-2和IFN-γ。HMGB1基因敲除的坏死细胞失去使活化单核细胞释放TNF-α的能力，进一步证实在坏死细胞中HMGB1是一种促炎细胞因子。

外源性给予HMGB1或B盒，CaCo-2单层细胞通透性呈时间-剂量依赖性增加，提示HMGB1是破坏上皮细胞屏障的调节因子。进一步实验发现，HMGB1通过MAPK、NF-κB和一氧化氮信号通路调节上皮细胞通透性[24]。因此推测，血清HMGB1水平的增加使上皮细胞屏障破坏导致疾病加重。

5.2 动物实验 在脓毒症小鼠模型中，HMGB1首次被证实为一种晚期炎症介质[4]。HMGB1作为一种促炎因子，加重小鼠炎症和毒性反应，使小鼠出现嗜睡、竖毛、腹泻、寒战及肺内和肝内的微血栓形成等内毒素血症的症状。当气道内给予小鼠重组HMGB1，肺部的炎症反应表现为中性粒细胞积聚、肺水肿和肺内IL-1β、TNF-α及巨噬细胞炎症蛋白2增多。脑室内给予HMGB1可以使小鼠脑内TNF和IL-6生成增加，同时出现发热、厌食、味觉厌恶、体重减轻等症状。

小鼠内毒素血症发生后8～32 h，血清HMGB1水平增高，脓毒症或急性肺损伤等炎症反应进展加重。与正常对照组相比，给予LPS后，HO-1基因敲除小鼠血清HMGB1水平明显增加，这种高水平的HMGB1严重影响内毒素血症的预后[25]。在小鼠脓毒症模型中，血清HMGB1的水平与病情的严重程度密切相关。无论先后给予内毒素实验组抗-HMGB1抗体治疗，病情发展都明显减缓，而给予HMGB1则使病情明显恶化，说明HMGB1是内毒素致死作用的内源性介质。A盒可以拮抗HMGB1在脓毒症中的致炎作用，控制脓毒症的发展。在鼠类脓毒症模型中，给予特异内源性HMGB1抑制剂如抗-HMGB1 A盒或RAGE拮抗剂，能阻止器官损伤的进展，改善预后[26]。

HMGB1与神经系统疾病同样存在相关性。促炎细胞因子刺激HMGB1从垂体细胞和星状细胞释放。鼠类大脑神经元和星状细胞中HMGB1高度表达，在脑缺血时释放，导致神经炎症反应及脑缺血损伤。

5.3 临床研究 HMGB1由激活的单核/巨噬细胞主动释放，或由坏死细胞被动释放。临床观察研究证实，HMGB1加剧炎症反应，造成急性组织损伤。脓毒症患者的血清/血浆HMGB1水平上升。与生存组相比，脓毒症患者死亡组血清HMGB1水平更高，提示HMGB1可以作为治疗的一个靶点。

Sunden-Cullberg等[27]研究发现，脓毒症患者血清HMGB1水平增高，但其与感染的严重程度或其他细胞因子并无明确的相关性，这可能与Sunden-Cullberg等[27]的研究人群仅局限于中重度脓毒症患者有关。后来的研究发现，感染性休克患者血浆HMGB1浓度与器官损伤程度相关，且病情重的患者HMGB1水平增长持续时间更长[28]。越来越多的研究证实，HMGB1可以诱发炎症反应，并且在内毒素血症或脓毒症中作为一种晚期炎症介质加重病情。

在感染组织局部，HMGB1浓度同样升高。Ueno等[29]发现，脓毒症患者肺泡上皮黏液层HMGB1浓度升高。无论脓毒症的原发感染部位为何处，血清HMGB1水平都升高。与肺炎或腹膜炎引发的脓毒症相比，泌尿系感染诱发的HMGB1的释放相对延迟。van Zoelen等[30]也发现，HMGB1释放主要来自感染局部。但脓毒症患者局部HMGB1的释放对血清HMGB1水平的影响程度以及对原发感染部位、远隔器官的损伤程度仍有待研究。Kornblit等[31]发现，HMGB1基因变异可以改变脓毒症患者预后，这提示HMGB1基因治疗可以作为未来的研究方向。

5.4 HMGB1 B盒的促炎作用 HMGB1的促炎区域位于B盒，它可以快速有效地激活巨噬细胞，诱导树突细胞成熟、增加促炎因子IL-1、IL-6、IL-8、IL-12和TNF-α的分泌。B盒通过p38 MAPK途径上调CD83的表达和IL-6的分泌。在混合淋巴细胞，B盒激活的树突细胞可以有力地活化同种反应性T细胞，诱导树突细胞分泌IL-12及同种反应性T细胞分泌IL-2、IFN-γ。树突细胞受坏死细胞释放的HMGB1刺激后，增强免疫应答反应，加剧组织细胞损伤。外源给予大鼠抗-B盒抗体可以显著降低内毒素血症和脓毒症的病死率，起到保护作用。缺血再灌注损伤所致的炎症反应会导致肠屏障受损，体外实验发现，B盒会影响肠屏障功能并加剧Caco-2单层细胞通透性[24]。Yang等[32]发现，重组A盒可以抵消HMGB1或B盒的促炎作用。

HMGB1和B盒均可剂量依赖性激活人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)，上调黏附因子如细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、血管内皮黏附分子-1(VCAM-1)和E-选择素(E-selectin)表达，释放IL-8和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。HMGB1激活HUVEC，促使ELK-1磷酸化，发出信号使蛋白转录，p65和c-Rel向核内转移。这提示HMGB1是通过NF-κB途径调节内皮细胞活性的。

5.5 细胞内HMGB1促炎信号传导通路 炎症反应时，HMGB1在胞内信号通路的研究较少。HMGB1可以磷酸化MAPK家族成员，包括p38 MAPK、p44/42 MAPK、SAPK/JNK，诱导大鼠和人类巨噬细胞产生促炎因子，并通过RAGE途径使NF-κB解离活化。因此，利用MAPK阻断剂抑制HMGB1激发细胞因子级联反应和NO的产生，可作为一种新的治疗方法。最近发现，坏死细胞释放的HMGB1作为内源危险信号加剧单核/巨噬细胞的促炎反应，使TREM-1向下游传递信号激发细胞因子级联反应，这种机制可以导致严重反应加剧和持续存在[33]。

在人类中性粒细胞，HMGB1明显激活p38，部分激活ERK1/2、PI3K-Akt，促进NF-κB核转位，增强促炎因子表达。p38 MAPK通路抑制剂可以阻断HMGB1介导中性粒细胞产生促炎因子的作用，说明p38 MAPK通路在HMGB1促炎过程中发挥了重要作用。在内皮细胞，HMGB1诱导MAPK瞬时磷酸化，上调黏附因子表达，调节纤维蛋白溶解，加剧炎症反应。在树突细胞，HMGB1和B盒可以活化NF-κB和ERK通路，NF-κB通路可以促使树突细胞分化成熟，而ERK通路调节树突细胞的存活。因此，HMGB1对树突细胞尤为重要。

研究结果提示，HMGB1通过MAPK通路诱导促炎因子释放，为脓毒症治疗提供了新靶点，应用MAPK阻断剂，抑制HMGB1促炎作用可以作为治疗脓毒症的研究方向。

6 HMGB1拮抗剂

在内毒素血症或脓毒症等炎性疾病模型中，除了特异性抗体，给予HMGB1拮抗剂丙酮酸乙酯、槲皮素、绿茶和姜黄素也可以起到保护作用[34]。尼古丁和乙酰胆碱可以抑制内毒素或TNF-α诱导的HMGB1释放。烟碱可以阻断NF-κB通路的激活，使经特异性烟碱抗炎途径的HMGB1分泌被抑制。因此，应用选择性烟碱激动剂激动α7nAChR可以作为治疗脓毒症的新方法。这个机制的重要意义在于，HMGB1为生存所必需，而乙酰胆碱的存在并不影响胞内HMGB1的水平。

最近研究发现，丙酮酸乙酯能明显降低血清HMGB1水平[35]。在内毒素血症和脓毒症小鼠模型中，实验组较对照组的生存率明显提高。丙酮酸乙酯能特异性抑制p38 MAPK和NF-κB信号传导通路。因此，外源性给予巨噬细胞RAW264.7丙酮酸乙酯时，内毒素组的HMGB1释放被显著抑制。齐墩果酸能够激活Nrf2，继而诱导HO-1合成，后者能抑制LPS刺激RAW264.7释放HMGB1。Hidaka等[36]发现，加贝酯可以抑制纤溶酶原激活物抑制剂-1(plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1)和蛋白酶活化受体-2(protease-activated receptor-2 ,PAR-2)，间接抑制HMGB1表达，减轻肺组织损伤。因此，加贝酯可以作为阻止或缓解脓毒症肺损伤的新疗法。

绿茶的主要成分表没食子儿茶素没食子酸酯可以剂量依赖性地阻止单核/巨噬细胞释放HMGB1。即使盲肠结扎穿刺24 h后，腹膜内注射表没食子儿茶素没食子酸酯，仍可以缓解脓毒症病情进展[37]。抗菌肽CAP11也可以显著阻止LPS与RAW264.7细胞的结合，抑制内毒素休克鼠类的血清HMGB1水平的上升，降低病死率。研究结果提示，HMGB1拮抗剂可以作为脓毒症和其他严重炎性疾病的治疗手段。

7 结 语

脓毒症有极高的发病率和病死率，目前尚无有效的治疗方法。HMGB1作为一种晚期炎症介质的发现，为脓毒症的治疗指引了新的研究方向。发病24 h后，有效地给予针对抗HMGB1的靶向延期治疗，为改善脓毒症预后提供了独特的时间窗。但关于HMGB1释放的调节机制、与HMGB1作用的表面受体、HMGB1作为促炎因子在胞内信号传导通路等机制仍需进一步研究。这些问题的解决将为认识脓毒症的发病机制、改善脓毒症预后提供新的思路。

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