黑逍遥散含药血清对PC12两种AD模型的LDH、T-SOD、MDA的影响*

吴红彦， 邓健男， 李海龙， 杨植媛， 邱家权， 夏 琦

(1.甘肃中医学院， 甘肃 兰州 730000； 2.甘肃省中药药理与毒理学重点实验室、甘肃省中药新产品创制工程实验室， 甘肃 兰州 730000)

老年性痴呆，又称阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease，AD)，是一种病程隐匿、缓慢的神经退行性疾病。现代医学研究表明，AD的发病机制极为复杂，现AD的发病机制学说已经达到十余种[1-2]。在其众多的病因学说中，氧化应激学说占据着主导地位[3]。中医目前多将此病归于“神呆”范畴。认为其病位在脑，与心、肝、肾功能失调关系密切[4]。发病以内因为主，气、血、痰、瘀缠结为患。脑髓空虚，气血不足致心神失养，属本虚标实之疾[5]。现有的动物实验研究也印证了从肝脾论治的可行性[6-9]。本次实验分别参考王亚利[10]、曲喜英[11]等的，建立AD两种经典的体外模型，运用肝脾肾同治的黑逍遥散(逍遥散+熟地黄)含药血清干预AD体外模型，以期进一步阐释黑逍遥散治疗AD的机理。

1 材料与仪器

SPF级大鼠40只，雌性，体重(200±20)g，由甘肃中医学院科研动物实验中心提供。黑逍遥散各组药材均由甘肃中医院药房提供，LDH、T-SOD、MDA试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供，批号：20110928。DMEM培养基由sigma公司提供，批号：20120430。Aβ25-35淀粉肽由上海强耀生物科技有限公司提供，批号：20120405；双氧水批号：121109。PC-12细胞由上海中科院生物研究所提供。Benchmark plus连续波长酶标仪(上海新振仪器设备有限公司)，倒置显微镜(日本奥林巴斯光学株式会社，型号：IX71)。

2 方法

3 结果

3.1 不同浓度黑逍遥散含药血清对两种造模方法PC12细胞活力的影响 与空白对照组比较，淀粉肽溶液(20μmol/L)模型组细胞存活率显著降低，差异有显著意义(P<0.05)；与模型组比较，各个给药组细胞存活率有显著提高，差异有显著意义(P<0.05)。(见表1)

表1 黑逍遥散含药血清对淀粉肽(20μmol/L)造模各组细胞存活率的影响

与空白对照组比较，H2O2溶液(300μmol/L)模型组细胞存活率显著降低，差异有显著意义(P<0.05)；与模型组比较，各给药组细胞存活率明显提高，差异具有显著意义(P<0.05)。(见表2)

表2 300μmol/L的H2O2溶液造模组测试PC12细胞存活率的影响

3.2 不同浓度的黑逍遥散对两种造模方法PC12细胞T-SOD、LDH酶活性及MDA含量的影响 与空白对照组比较，淀粉肽溶液(20μmol/L)模型组T-SOD酶、LDH酶活性显著下降，MDA含量显著升高，2组差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，各组细胞溶液T-SOD酶、LDH酶活性显著增强，MDA含量显著降低(P<0.05)。当不同浓度的黑逍遥散含药血清作用于PC12细胞后，与血清组比较，10%浓度含药血清细胞组T-SOD酶、LDH酶活性显著增强，MDA含量显著降低(P<0.05)。(见表3)

表3 淀粉肽(20μmol·L-1)干预72h后对PC12细胞的酶学指标影响

3.3 与空白对照组比较，H2O2(300μmol/L)模型组T-SOD酶、LDH酶活性显著下降，MDA含量显著升高，2组差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，各组细胞溶液T-SOD酶、LDH酶活性显著增强，MDA含量显著降低(P<0.05)。当不同浓度的黑逍遥散含药血清作用于PC12细胞后，与血清组比较，10%浓度含药血清细胞组T-SOD酶、LDH酶活性显著增强，MDA含量显著降低(P<0.05)。(见表4)

表4 H2O2(300μmol/L)干预16H对PC12的酶学影响

4 讨论

AD有三大病理特征：老年斑、神经元大量丢失、神经纤维缠结。已经有文献表明[3，12]，氧化应激与AD的三大病理特征都有着密切关系：Aβ淀粉肽主要来自于Aβ肽的碳端蛋氨酸残基，后者能产生过氧化物并促进氧化反应，还可使可溶性Aβ淀粉肽变成不溶性淀粉肽，导致老年斑的产生；自由基能攻击不饱和脂肪酸，造成膜结构的损伤，破坏核酸，引起蛋白质表达异常，导致神经元凋亡；自由基还会引起钙离子超载，导致蛋白磷酸酶与蛋白酶比例失调，从而引起tau蛋白异常磷酸化，进一步形成神经纤维缠结。超氧化物歧化酶(SOD)是机体内清除自由基的重要酶之一，催化自由基的歧化反应，其活性直接反映出机体清除自由基的能力；在细胞受损时，乳酸脱氢酶(LDH)由细胞内流出，其浓度的高低，反映出细胞受损的程度；丙二醛(MDA)是脂质过氧化物的终端产物，可间接反映细胞受损程度，在神经细胞坏死中，AD的发生发展过程中，占有重要位置。

本次实验结果显示：与空白对照组比较，Aβ25-35淀粉肽(20μmol/L)与H2O2(300μmol/L)诱导的PC12损伤的模型组细胞存活率均显著降低，差异具有显著意义(P<0.05)：与两组模型组比较，各个给药组细胞T-SOD、LDH活性显著升高，MDA含量显著降低，差异具有显著意义(P<0.05)。

黑逍遥散方中组成药物看：当归、白术、茯苓、甘草有效成分阿魏酸、双白术内酯、茯苓多糖、异甘草素、甘草总黄酮有不同程度的抗氧化、抗衰老、提高记忆力等作用[13-17]，熟地具有雌性激素样作用，可能对痴呆有一定影响。史佳琳等[18]发现地黄寡糖预孵育能提高细胞存活率、减少LDH渗漏，从而减轻谷氨酸对神经细胞的损害程度。董榕等[19]发现柴胡注射液则能使噪音组迅速升高的T-SOD、MDA含量接近正常组，能明显增加小鼠正确反应次数(P<0.01)，结合本次实验结果黑逍遥散显示的抗氧化能力，这些也都为黑逍遥散治疗AD提供了药理学基础。

本次实验通过两个比较经典的AD体外模型实验进一步表明，黑逍遥散均能显著地提高机体T-SOD，LDH的生物活性，降低MDA含量，这也表明黑逍遥散治疗AD的功效可能与提高机体抗氧化能力密切相关。

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